肺腺癌差异表达的miRNA筛选研究

郑俊斌

(厦门市中医院检验科，福建 厦门 361000)

据2018年全球癌症统计数据显示，最常诊断出的癌症是肺癌， 被纳入研究的癌症病例有11.6%的病例确诊为肺癌，18.4%的癌症总死亡人数是由肺癌造成的[1]。肺癌常见形式是非小细胞肺癌，肺腺癌则是非小细胞肺癌中最常见的变异型。据报道，非小细胞肺癌(NSCLC)至少占肺癌病例的80%，这些病例可进一步分为腺癌(40%)、鳞状细胞癌(30%～35%)和大细胞癌(5%～15%)[2]。大多数晚期腺癌的患者5年生存率只有5%～20%[3]。肺癌的治疗方法包括手术、放疗和化疗，近年来，分子靶向治疗在晚期肺癌的治疗过程中发挥越来越大的作用，但由于不同个体的基因背景的差异，肺癌的诊疗仍然面临很多技术性难题[4]。

microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，主要通过转录后水平调控基因表达[5]。miRNAs是细胞生物学中重要的调控因子，调控靶基因的表达，可被视为细胞通讯的一部分[6]。本研究基于TCGA数据库中肺腺癌患者的miRNA表达谱数据，采用R语言程序包——limma包，筛选miRNAs表达谱终端差异表达的miRNAs，旨在探讨这些miRNAs与肺腺癌临床参数的关系以及与肺腺癌患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 数据下载与初步分析

从TCGA数据库获取miRNAs表达谱数据及患者的临床资料，病例均为经病理学检查确诊为原发性肺腺癌且术前未经过任何治疗；具备完整的临床分期资料和预后相关信息；表达谱数据基于肺腺癌患者癌组织和癌旁组织。

合计518例肺腺癌纳入分析，其中女性样本276例，年龄39～87岁，平均年龄(65±10)岁；男性样本242例，年龄38～88 岁，平均年龄(65±9.7)岁，一般资料见表1。纳入研究的病例在年龄、性别等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 518例肺腺癌患者的临床特点

1.2 数据处理

应用limma包处理miRNAs表达谱数据进行差异分析，筛选差异表达的miRNAs。以P<0.01且log2|差异倍数(FC)|≥1为筛选标准。

1.3 筛选与预后相关的miRNAs

对筛选出的多个差异表达的miRNAs进行分组，基于每个miRNA的表达量分为高表达组和低表达组。采取Kaplan-Meier生存曲线分析低表达和高表达的miRNA与总体生存期(OS)的相关性，获得与总体生存期显著相关的miRNAs。进一步应用单因素和多因素Cox回归模型分析与OS相关的miRNAs，获取风险比值(HR)。

1.4 差异表达miRNAs与临床参数的相关性

基于肺腺癌患者年龄、总体生存状态以及TNM分期进行分组，分析与OS相关的miRNAs与各临床参数的相关性。

1.5 统计学方法

运用R程序包(limma包和survival包)进行统计学分析。计数资料以率(%)表示；生存分析采用Kaplan-Meier曲线；Log-Rank方法检验miRNA低表达和高表达组生存率差异是否有统计学意义；多因素分析采用Cox比例风险回归模型， miRNA表达量和临床参数之间的关系采用χ2检验进行验证。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 差异表达miRNAs的筛选

筛选出基于癌组织与癌旁组织差异表达的miRNAs共计125个，其中95个上调miRNA，30个下调miRNAs。肺腺癌患者表达谱数据差异表达miRNAs分布情况见图1。

注：pvalue表示p值;FC表示差异倍数；棕色表示上调miRNAs，蓝色表示下调miRNAs

2.2 与OS相关的miRNAs筛选

基于每个miRNA的表达中值，将其分成高表达组和低表达组。以Kaplan-Meier生存曲线和Log-Rank检验方法分析125个差异表达的miRNAs和肺腺癌患者预后的相关性。结果显示，hsa-mir-9-2(P=0.020)、hsa-mir-9-1(P=0.028)、hsa-mir-9-3(P=0.020)、hsa-let-7c(P=0.025)、hsa-mir-29b-2(P=0.044)、hsa-mir-490(P=0.031)、hsa-mir-548v(P=0.001)和hsa-mir-375(P=0.038)与肺腺癌患者的预后呈显著相关。其中高表达hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-1和hsa-mir-9-3与预后差显著相关，而低表达hsa-let-7c、hsa-mir-29b-2、hsa-mir-490、hsa-mir-548v和hsa-mir-375与预后差呈显著相关。见图2。

图2 与预后显著相关的miRNAs的生存曲线

单因素和多因素Cox回归分析验证结果显示，肺腺癌患者的预后与差异表达的miRNAs具有相关性，高表达hsa-mir-9-2(P=0.020)、hsa-mir-9-1(P=0.028)和hsa-mir-9-3(P=0.020)和低表达hsa-let-7c(P=0.025)、hsa-mir-29b-2(P=0.044)、hsa-mir-490(P=0.031)、hsa-mir-548v(P=0.001)和hsa-mir-375(P=0.038)是肺腺癌患者预后不良的独立预后因素。见表2。

表2 肺腺癌患者差异表达miRNAs的Cox回归分析

3 讨 论

microRNA是内源性基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，大约一半(52%)的人类microRNA位于基因间区域，40%位于基因的内含子区域，8%位于外显子，microRNA积极参与各种抑癌基因和癌基因的调控，miRNA对基因表达的调控作用很大程度上是通过降解目标mRNA或干扰目标mRNA的翻译介导的[6]。研究证实，非编码RNA在肺腺癌进展中的发挥着关键作用。非编码RNA可能成为肺癌的早期生物标志物和治疗靶标。因此，靶向非编码RNAs可能是开发针对肺癌的新疗法并克服化学耐药性的有效方法[7]。

Ren等[5]认为，hsa-mir-486-1、hsa-mir-486-2、hsa-mir-153、hsa-mir-210、hsa-mir-9-1、hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-3、hsa-mir-577和hsa-mir-4732可作为诊断肺腺癌的特异性生物标志物。Lin等[8]认为，miR-548v高表达组的生存时间低于miR-548v低表达组的生存时间。在TCGA和GBM患者队列中，神经胶质瘤患者的miR-490表达明显下调[9]，SP1被证实是miR-490的靶标，敲低SP1可以逆转miR-490抑癌作用[10]。相关研究也表明，miR-21、miR-99B和miR-375可作为晚期直肠癌对于放化疗的敏感性的预测指标，从而减少放化疗对放化疗无反应性肿瘤患者的毒性不良反应[11]。miR-375可以有效抑制口腔鳞状细胞癌细胞中的SLC7A11水平而发挥抑癌作用[12]。miR-29b-2-5p在体内和体外能抑制细胞增殖，诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡，还通过靶向Cbl-b促p53表达来改善PDAC的预后，且将构成PDAC中的重要预后因素[13]。Glypican-3(GPC3)作为一种致癌基因，在肝恶性肿瘤(如肝细胞癌、肝母细胞瘤)中经常上调，且构成治疗肝癌的潜在分子靶标，miR-548v则可降低致癌基因GPC3的表达[14]。另外，let-7c也可能是潜在的乳腺癌治疗靶标[15]。

本研究对TCGA中肺腺癌患者miRNA表达谱数据进行统计学分析，筛选得到与肺腺癌预后显著相关的miRNAs有8个，hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-1、hsa-mir-9-3、hsa-let-7c、hsa-mir-29b-2、hsa-mir-490、hsa-mir-548v和hsa-mir-375，其中高表达hsa-mir-9-2、hsa-mir-9-1和hsa-mir-9-3与预后差显著相关，而低表达hsa-let-7c、hsa-mir-29b-2、hsa-mir-490、hsa-mir-548v和hsa-mir-375与预后差显著相关。综上所述，部分miRNAs与肺腺癌的临床参数和预后存在显著相关性，可为为寻找肺腺癌新的诊断和预后生物学标志物以及个性化治疗提供新思路。