长链非编码RNA LINC00662在神经母细胞瘤中的表达及生物学作用

叶梦婷，周佩燕

(1.广州医科大学附属第五医院，广东 广州 519000；2.广州市白云区第三人民医院，广东 广州 510000)

神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。神经母细胞瘤起源于原始的神经脊细胞，恶性程度高、进展快、预后差，在早期即容易发生骨髓转移和远处转移。近年来，尽管对神经母细胞瘤的治疗方式(包括手术切除、放疗、化疗以及分子靶向治疗等)取得了很大的进展，但是患儿的5年生存率仍低于40%，严重威胁患儿的身体健康[3]。因此，我们亟需筛选出神经母细胞瘤的关键生物学标志物，并阐明其在调控神经母细胞瘤的恶性增殖以及高度侵袭性的生物学机制，进而在基因层面干预肿瘤的恶性进展。

长链非编码RNA(LincRNA)是一种由基因组中非编码序列转录生成的，其核酸序列长度一般大于200个碱基，不具有翻译成蛋白质的能力[4,5]。研究发现，长链非编码RNA具有广泛的组织表达谱，与编码蛋白质的mRNA相比较，其具有更强的组织和细胞表达特异性。越来越多的研究表明，LincRNA在调节恶性肿瘤细胞的增殖能力、侵袭转移能力等多个方面发挥重要作用[6,7]。其中，linc00662就是一种能调控肿瘤细胞恶性进展的关键分子标志物，其定位于人类染色体19q11的内含子LincRNA，长度为2085bp。近年来，linc00662已被鉴定为各种癌症中的一种关键致癌基因，包括胃癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌等[8-10]。然而，目前尚不清楚LincRNA00662在神经母细胞瘤中的表达及生物学效应。基于此，本研究主要探索LincRNA00662在神经母细胞瘤中的表达特性及其与患儿临床病理特征之间的关系，并进一步研究其对正常背根神经节细胞和神经母细胞瘤细胞的增殖能力及侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 组织样本信息

本研究共收集40对神经母细胞瘤组织和配对的正常组织标本，并且对其临床病理特征进行评价。所有参与本研究的组织样本均购买于广州铖铵生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

人类神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH，IMR-32，Kelly和SH-SY5Y)和正常背根神经节(DG)细胞均从中国上海公司ATCC获得。将细胞系培养在含10%胎牛血清的McCoy’s5a培养基中(Gibco,Grand Island,NY ,USA)以37 ℃、5%CO2的环境培养。

1.3 RNA干扰

我们采用小RNA干扰技术(siRNA)以及脂质体3000转染试剂(美国Thermo Fisher) 构建linc00662表达下调的神经母细胞瘤细胞系 (siRNA-1和siRNA-2三组)。同时用相应的阴性对照(NC)序列(si-Control) 转染细胞系。

1.4 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测

首先，用试剂TRIzol (Invitgen，USA)从冰冻组织和细胞系中提取总RNA，然后用PrimeScript RT Master Mix(T Akara)转录成cDNA。随后，使用试剂盒SYBR PreMix Ex T AQ II Kit(T Akara)分析linc00662的表达。并以β-肌动蛋白作为内源性对照。本研究使用的引物下所示：linc00662,5’-CAC GCT TCT GAA ACT GGT GT-3’,5’-TGT ACA GCC TGG TGA CAG AG-3’; β-actin,5’-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TTC-3’,5’-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C -3’.

1.5 CCK-8测定

首先，收集linc00662基因敲低的SH-SY5Y细胞株，以适当的浓度(5×103个细胞/孔)接种于96孔板中。培养24、48、72、96h后，在McCoy's 5a培养基(CCK-8，Dojindo)中，每孔加入含10%CCK-8溶液100 μL。最后，使用微型平板读取器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)读取每孔的OD值。

1.6 流式细胞仪分析

本研究为了对神经母细胞瘤细胞周期进行分析，采用细胞周期检 测试剂盒(Keygen,Nanjing,China)进行处理。并且我们采用FACSCantoII流式细胞仪(BD Biosciences)检测处于细胞的细胞周期阶段细胞百分比。

1.7 细胞迁移和侵袭性分析

本研究为了评估细胞迁移，我们将收集处理后的细胞用无血清培养基进行培养，并将4×104细胞加入培养基 (0.8 μm; Corning,NY ,USA) 的上层并且在下层中加入含2 0%胎牛血清的McCoy5a培养液500 μL。24 h后用4%多聚甲醛固定细胞，并用试剂0.1% crystal violet染色，最后使用光学显微镜成像观察。

1.8 统计分析

本研究所有数据均以均数±标准差(SD)表示，所有实验至少重复三次。生存资料采用Kaplan-Meier方法进行分析并使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software,San Diego,California,USA)进行曲线拟合分析。所有其他数据均采用Student's t-test进行评估。当P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床表达与临床参数相关性

为了进一步探索LINC00662在神经母细胞瘤中的生物学调控作用，我们首先检测其在神经母细胞瘤组织以及外周正常组织中的表达水平。qPCR结果显示：LINC00662在神经母细胞瘤中的表达水平明显高于外周的正常组织(图1，***P<0.001)。此外，我们根据LINC00662的表达水平中位数将40例患儿标本分为高表达组和低表达组，并进行卡方检验，结果显示：LINC00662高表达往往与肿瘤分化程度低(P=0.008)、肿瘤分期晚(P=0.0267)以及淋巴结侵犯(P=0.011)等有着密切的联系(表1)。这提示LINC00662有可能在神经母细胞瘤发生发展中担任促癌角色。

表1 LINC00662表达水平和儿童神经母细胞瘤临床病理参数的关系

图1 LincRNA00662在神经母细胞瘤组织及外周正常组织中的表达水平，***P<0.001

2.2 神经母细胞瘤细胞内LINC00662的表达水平及LINC00662低表达的细胞模型构建

为证实LINC00662是否与具有神经母细胞瘤发生发展相关，我们首先检测神经母细胞瘤细胞以及正常背根神经节细胞中LINC00662的表达水平，qPCR结果显示：相对于正常背根神经节细胞，LINC00662在神经母细胞瘤细胞中的表达水平均明显上调，其中SH-SY5Y细胞在所有神经母细胞瘤细胞中呈现相对高表达状态(图2A)。基于此，我们利用脂质体转染技术构建LINC00662低表达的神经母细胞瘤细胞株，结果提示：相对于阴性对照组(si-Control)，siRNA转染组(siRNA-1和siRNA-2)可显著抑制SH-SY5Y细胞内LINC00662的表达水平(图2B)，这提示LINC00662低表达的SH-SY5Y细胞模型被成功构建，可用于后续的功能实验。

注：A.LINC00662在人类神经母细胞瘤细胞和正常背根神经节细胞中的表达水平；B.LINC00662低表达的神经母细胞瘤细胞株的构建，***P<0.001。

2.3 敲低LINC00662的表达后能显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖能力

无限增殖能力是所有恶性肿瘤的基本生物学特征，因此在本研究中我们通过CCK-8实验来进一步探索LINC00662对细胞增殖能力的影响，实验结果显示：下调SH-SY5Y细胞中LINC00662的表达后，细胞的增殖水平较对照组显著明显减慢(图3)，这说明敲低细胞内LINC00662的表达能显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖能力。

2.4 敲低LINC00662的表达后对神经母细胞瘤细胞周期分布的影响

为进一步明确LINC00662对神经母细胞瘤细胞恶性增殖能力调控的作用机制，在本研究中我们利用流式细胞学技术检测细胞周期分布情况，结果显示：与对照组相比较，敲低细胞内LINC00662的表达后能使得S期细胞的比例明显下降、而G2/M期的比例明显增加，差异有统计学意义(图4)。这提示敲低LINC00662的表达能诱导更多的神经母细胞瘤细胞阻滞在G2/M期，进而抑制神经母细胞瘤的恶性增殖能力。

2.5 敲低LINC00662的表达后能显著抑制神经母细胞瘤细胞的侵袭及转移能力

为了进一步探究LINC00662对神经母细胞瘤细胞侵袭转移能力的影响，在本研究中我们还进行了Transwell实验，结果显示：与对照组相比较，siRNA-1和siRNA-2组的细胞侵袭与转移数目均显著减少(图5)，这说明敲低LINC00662表达后能显著抑制细胞的侵袭转移能力。

注：***P<0.001。

si-ControlsiRNA-1siRNA-2100080060040020001000800600400200010008006004002000204060801002000si-ControlsiRNA-1siRNA-26040200CellcycledistributionG1G2/MSDpG1DpG2DpSDpG1DpG2DpSDpG1DpG2DpS***********204060801002000204060801002000

注：***P<0.001。

3 讨 论

神经母细胞瘤是婴儿与儿童最常见的颅外实体肿瘤[3]。近年来，随着社会经济水平的提高和人们生活方式的改变，儿童的神经母细胞瘤的患病率呈逐年增加的趋势，已经成为威胁儿童生命安全的重要疾病[11]。在日常诊疗中，神经母细胞瘤起病隐匿、早期症状不明显、极易发生远处转移[12]，尽管神经母细胞瘤的的早期筛查、诊断及治疗方面取得了较明显的进展，但患儿的5年生存率仍处于较低的水平。其实，肿瘤的恶性演变过程是一个多因素、长期累积突变的过程，阐明其发生机制可能为儿童神经母细胞瘤的治疗带来新的希望。随着高通量测序技术及分子生物学的进步，寻找神经母细胞瘤的关键调控靶标成为了可能，这将为临床决策提供关键性的指导作用。

近年来，研究发现长链非编码RNA在染色体构象、转录和转录后调控等多个过程起着关键的调控作用，并参与恶性肿瘤的增殖、周期和侵袭转移等生物过程[13]。随着对长链非编码RNA分子研究的不断深入，我们发现许多LincRNA的表达具有高度的组织特异性，有望成为恶性肿瘤的潜在生物学标志为，具有巨大的应用前景[14,15]。其中，linc00662是一个新近发现的调控分子，主要定位于人类染色体19q11的内含子上。Wang等人发现LINC00662在脊髓瘤的恶性进展中起着重要的调控作用，其主要通过调控miR-16-5p/RNF44B信号轴促进脊髓瘤细胞增殖、集落形成以及侵袭转移的发生[16]。此外，Yao等人发现抑制细胞内LINCRNA00662的表达后，能通过调控miR-145/c-myc轴抑制结直肠癌细胞的增殖能力、诱导更多的结直肠癌细胞发生凋亡[17]。然而，迄今为止，LINC00662在神经母细胞瘤中的表达方式和生物学功能尚不清楚，有待进一步的探索。

基于此，为明确LINC00662在神经母细胞瘤中的生物学调控作用，在本研究中我们首先通过RT-qPCR技术检测并分析了40例配对的儿童神经母细胞瘤组织及外周正常组织标本中LINC00662的表达水平，结果发现神经母细胞瘤组织中LINC00662的表达水平明显高于癌旁正常组织。此外，统计学结果也一致表明，LINC00662的高表达状态往往预示着患儿肿瘤分化程度低、肿瘤分期晚以及淋巴结侵犯。由此可进一步推测，对于神经母细胞瘤患儿，LINC00662的表达水平越高意味着患儿的预后差、死亡率高，这提示LINC00662有可能在神经母细胞瘤中起促癌作用。

为进一步明确LINC00662的生物学作用，我们通过脂质体转染技术成功构建了LINC00662过表达的神经母细胞瘤细胞模型。研究结果提示，抑制细胞内LINC00662的表达后能显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖能力，但其机制尚不明确。既往研究发现，LincRNA的表达调控能通过诱导细胞增殖周期阻滞进而影响细胞增殖水平[18-19]。Li等研究人员发现lncRNA CASC11能通过调控miR-340-5p/CDK1信号轴，进而诱导细胞周期阻滞，抑制胃癌细胞增殖[20]。因此，在本研究中，我们通过流式细胞学技术检测细胞周期的分布情况。有趣的是，研究发现下调细胞内LINC00662能诱导更多的神经母细胞瘤细胞阻滞在G2/M期，进而发挥细胞增殖抑制效应。同时，侵袭转移特性强是神经母细胞瘤细胞的重要生物学特征。因此，在本研究中，我们利用Transwell实验探索LINC00662对神经母细胞瘤细胞侵袭转移能力的影响，结果发现敲低细胞内LINC00662的表达能显著抑制细胞侵袭转移能力。

综上所述，LINC00662在神经母细胞瘤中呈高表达状态，下调其的表达能通过诱导细胞周期阻滞、抑制细胞增殖能力以及侵袭转移能力，进而发挥抑癌作用。LINC00662有望成为神经母细胞瘤治疗的潜在预测指标及治疗靶点，通过干扰其表达能最大程度的改善神经母细胞瘤患儿的临床预后。