急性肺动脉高压大鼠模型建立与评价

廖东江,卢心鹏，冼慧仪

(1.广州医科大学附属第一医院 广州呼吸健康研究院 呼吸疾病国家重点实验室 国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，广东 广州 510120；2.广东工业大学，广东 广州 510520)

肺动脉高压(Pulmonary Hypertension，PH)是一种罹患致死性疾病。最新研究表明，其患病率约占人群中4.3%[1]。近年来随着靶向药物的广泛应用，肺动脉高压患者生存预后得到一定程度上的改善，但仍不十分理想。国外一项肺动脉高压登记注册研究表明，肺动脉高压患者1年、3年、5年、7年生存率分别为91%、85%、68%、49%[2]。因此深入研究其发病机制及新型靶向药物亟不可待。

动物模型是我们研究疾病的发病机制及药物研发的重要工具。目前肺动脉高压的动物模型多以慢性为主，包括自发性、MCT诱导性、低氧性、肺高血流性、栓塞性、双重打击性[3]。急性肺动脉高压动物模型最早报道于1971年[4]，目前大多数采用大型动物如羊、猪等制备，但由于麻醉难度大、动物饲养场地要求高、成本高昂等原因难以推广。近年来也有越来越多学者尝试使用大鼠制备急性肺动脉高压(acute pulmonary hypertension,APH)模型，但效果并不好[5,6]。因此，本研究旨在建立简便、易于复制的急性肺动脉高压大鼠模型，为肺动脉高压的发病机制及靶向药物的开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠12只(180 g～200 g)，由广东省实验动物中心提供(许可证号：SCXK(粤)2018-0002)，完全随机分为模型组及模型+曲前列尼尔组。

1.2 主要试剂与仪器

U46619 -血栓烷A2(thromboxane A2，TxA2)的类似物购于美国Cayman公司，曲前列尼尔注射液购于中国李氏大药厂公司，Powerlab(8通道)、Labchart pro、生理压力换能器、血压放大器、动物生理放大器均购于澳大利亚AD instrument公司。

1.3 急性肺动脉高压大鼠模型的建立

大鼠采用戊巴比妥钠麻醉，首次麻醉剂量为50 mg/kg，90 min后根据大鼠呼吸频率和痛觉刺激调整麻醉药物：若呼吸频率大于75 次/分钟，大鼠脚板压痛反射可引出，补充15 mg/kg的戊巴比妥钠。麻醉平稳后，观察大鼠呼吸情况，大鼠呼吸频率在60-75 次/分钟为宜。将两根20 cm长PE10管，置于大鼠左右两侧尾静脉。将两根PE10管固定后，开始注射生理盐水(0.5 ml/h)，用于补充手术中的体液损失。电极针分别插入大鼠的双上肢和右下肢皮下，工作电极正极(红色)于右上肢，参比电极负极(绿色)于左下肢，参比电极右下肢(黑色电极)。测定基础值右心室收缩压(right ventricular systolic pressure， RASP)及心率后，两组大鼠分别用于连续注射U46619 (剂量在(150-300)ng/kg/min调整，维持RVSP在35 mm Hg左右)， 10 min后RVSP开始升高，RVSP持续升高10 min后分别予生理盐水、曲前列尼尔(100 ng/kg/min)持续注射。实验过程持续监测两组RVSP及心率。

1.4 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠右心室收缩压变化情况

模型组及模型+曲前列尼尔组基础RASP分别为(25.68±3.92)mm Hg、(24.11±7.11)mm Hg，两组间基础RVSP无显著差别(t=0.464，P=0.654，n=6)(图1)。注射U46619后两组RVSP分别上升至(38.72±5.16)mm Hg、(38.39±4.05)mm Hg，分别与两组基础值比较，RVSP显著升高，结果具有统计学意义(t=-4.928，t=-3.90；P=0.01，P=0.05；n=6)。持续注射U46619 20 min后，模型组、模型+曲前列尼尔组分别持续予生理盐水、曲前列尼尔注射。曲前列尼尔持续注射17分钟后，大鼠RVSP下降至(31.48±5.13)mm Hg，较使用曲前列尼尔前RVSP显著下降(t=2.437，P=0.035，n=6)。

注：Model代表模型组，Treprostinil代表模型+曲前列尼尔组。

2.2 大鼠心率变化情况

与模型组(305.84±35.98)bpm相比，模型+曲前列尼尔组基础心率(351.30±43.59)bpm，两组间无显著差别(t=﹣1.898，P=0.09，n=6)(图2)。与基础心率相比，持续注射U46619后两组心率分别为(285.57±41.19)bpm和(348.14±36.79)bpm 无显著增加(t=1.11，t=-0.554；P=0.30，P=0.59；n=6)。另外，曲前列尼尔持续注射17分钟后，模型+曲前列尼尔组的心率为(336.11±47.68)bpm，与注射曲前列尼尔前无明显差别(t=0.489，P=0.64，n=6)。

注：Model代表模型组，Treprostinil代表模型+曲前列尼尔组

3 讨 论

U46619 是TxA2的类似物，它可以激活蛋白激酶C相关激酶(protein kinase C-related kinase，PRK) 催化磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate，PIP2)转化为三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)。随后IP3与内质膜或液泡膜上的IP3-闸门Ca2+通道结合，使Ca2+通道打开，引起Ca2+内流，细胞质中Ca2+浓度高；IP3还可以促进细胞内钙库的释放，进一步增加胞质Ca2+的浓度。研究证实U46619可通过上调动脉平滑肌细胞中钙离子浓度，可以引起离体肺动脉[7-9]、海绵体阴茎动脉[10]、肠系膜动脉[10]的急性收缩。此外，利用U46619研究者还建立了猪[11-16]、羊[17-20]、犬[21-24]、兔[25-27]的急性肺动脉高压动物模型。

曲良超等利用双心房输注前列腺素E1和去氧肾上腺素构建了犬APH模型[28]；陈洪茂等[29]、李娟等[30]、吴文振等[31]通过从股静脉注射自体血栓的方法建立了兔、犬 APH模型；徐卓明等[32]、夏红萍等[33]成功建立低氧诱导的幼猪APH模型。这些急性肺动脉高压模型主要使用大型动物建立，但大型动物对麻醉、饲养和实验场地、费用均要求较高，不利于推广。自体血栓构建的APH动物模型亦有缺点：个体差异大、结果重复性较差、肺动脉压力难以达到一个稳定状态。缺氧诱导的APH，对设备、场地要求高，肺动脉压力同样不能达到一个较为稳定的状态，这些缺点限制了该模型的应用。最近学者尝试通过低氧[34]、肺动脉结扎[5]、U46619联合L-硝基精氨酸甲酯(L-N-nitro-arginine methylester,L-NAME)[6]建立急性肺动脉高压大鼠模型，但是方法繁琐，成功率不高。为了建立一个易于复制、简便的APH模型，我们通过在大鼠体内静脉连续注射U46619，结果显示我们成功诱导出APH大鼠模型，且模型组心率在肺动脉压力升高过程中无明显波动。

曲前列尼尔,是一种稳定的前列环素类似物，用于治疗PAH。该化合物可以激动前列环素信号通路，舒张平滑肌，抑制血小板聚集及平滑肌细胞增生，具有良好的疗效和安全性。曲前列尼尔在不同类型肺动脉高压患者的应用已被广泛认可[35-38]。为了证实APH大鼠模型的肺动脉压力的可逆性，在U46619诱导的肺动脉动脉压力升高后，我们予持续曲前列尼尔注射，17 min后肺动脉压力明显下降。这提示APH大鼠模型肺动脉压力可逆，对靶向药物筛选具有十分重要意义。

综上所述，用U46619持续静脉注射法可以有效建立一种APH大鼠模型，且步骤简单，成功率高。模型组大鼠右心室压力升高明显、符合PH血流动力学特点。该模型将为PH的发病机制及研究血管收缩相关靶向药物研发等提供一定的实验依据。