嫩食型南瓜种质资源遗传多样性的ISSR分析

荆赞革，吕 叶，裴徐梨，焦 鹏，朱丽瑞，杨四玉

(昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214)

分子标记是DNA水平遗传多态性的直接反映．目前，应用较普遍的有RFLP、RAPD、AFLP和SSR等分子标记．此外，简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)分子标记技术也广泛应用于品种鉴定[1]、遗传多样性分析[2]、基因定位[3]、植物基因组作图以及指纹图谱建立[4]．例如：陈桂平等[5]利用ISSR标记对无花果品种进行鉴定，发现引物811F和836F可特异性将2号和20号种质资源区分出来；王庆军等[6]对观赏石榴进行遗传多样性分析，发现其遗传变异较大，存在较丰富的遗传多样性；Kojima等[7]利用分子标记构建了小麦品种的遗传连锁图，发现多个ISSR位点可被定位到染色体上；邵雪花等[8]采用ISSR标记对余甘子品种的遗传多样性进行了分析和指纹图谱建立，发现只需引物UBC809和引物UBC886就可成功区分广东省的28份余甘子种质资源．

嫩食型南瓜主要以嫩瓜作为食用对象，深受消费者的喜爱．但是，嫩食型南瓜栽培品种由于地区间相互引种、自繁自育等原因，导致一些地方资源种源混杂，种性退化严重等问题，给资源搜集和新品种育种造成较大困难[9]．因此，本研究利用ISSR分子标记技术对搜集到的嫩食型南瓜种质资源进行遗传多样性分析，鉴定其亲缘关系，以期为嫩食型南瓜的利用和新品种选育及育种提供一定的理论依据．

1 材料与方法

1.1 试验材料

以收集的多份不同类型的嫩食型南瓜品种为试验材料，具体名称见表1．

1.2 DNA的提取和引物筛选

种子催芽后进行穴盘育苗，待长到四叶一心时，使用植物基因组DNA提取试剂盒(Takara)提取叶片DNA．

ISSR引物根据已公布序列随机挑选合成．筛选出条带清晰、重复性好的引物，用于后续试验．

表1 用于ISSR标记分析的材料

1.3 ISSR-PCR反应和检测

PCR扩增程序为95 ℃变性 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存；扩增体系为DNA模板1.5 μL，引物1 μL，2×Mix 10.0 μL，ddH2O补足20 μL．通过1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测．

1.4 凝胶电泳产物检测与统计分析

根据迁移率不同，在同一位点有条带的标记为“1”，无条带的标记为“0”．利用NTsys2.10e软件进行聚类分析．

2 结果

2.1 ISSR-PCR扩增结果分析

本试验共筛选出17条扩增条带清晰、重复性较好的引物(表2)．这些引物共扩增出99条带，每个引物平均扩出条带为5.82条，多态性条带为97条，多态性比例为97.79%．其中：引物ISSR14和ISSR17扩增出的带数最多，为10条；ISSR18扩增出的带数则最少，只有4条，其中3条为多态性条带．图1显示了ISSR22引物扩增产物的电泳结果．

2.2 嫩食型南瓜品种聚类分析

利用分子标记检测数据构建亲缘关系聚类图(图2)．结果显示，在遗传相似系数0.74处，把嫩食型南瓜材料分为两大类(图2)．第1大类包含27份材料，其中：21(小青瓜)和22(精选七叶瓜)均来自山西，亲缘关系较近，位于同一个小的分支；1(浅花)和5(早喜一号)的亲缘关系很近，聚在一起，而3(珍玉四号F1)亲缘关系则与来自同一省份的1(浅花)稍远，但三者仍然聚在同一个小分支中；7(玉玲)、9(白花皮一串铃)、10(一串金二号)、12(一串铃花篮)、21(小青瓜)和22(精选七叶瓜)的遗传相似系数均在0.874以上，位于同一个大的分支．第2大类包含28[西葫芦(晶莹粹)]、29(黄皮笋瓜)，30(黑籽南瓜)、31(黄瓜)和32(西瓜)，这5份外群材料与嫩食型南瓜的亲缘关系较远．

图1 ISSR22引物扩增电泳结果

表2 ISSR 引物扩增及其结果统计

图2 嫩食型南瓜材料聚类分析图

3 讨论

遗传多样性是物种进化的本质，对于遗传多样性研究有助于种质资源的保护和利用[6]．前人已经使用不同的分子标记手段对南瓜的遗传多样性进行了分析，如：朱海生等[10]使用ISSR分子标记技术分析了南瓜种质资源的遗传多样性，发现6对引物中共获得条带125条，多态性比例为92%；朱白婢等[11]利用4对ISSR分子标记共扩增出条带63条，多态性条带有60条，多态性比例为93.38%．而本试验通过ISSR-PCR扩增出多态性条带比例为97.79%，如此高比例的多态性，可能是由于几个外群亲缘关系与南瓜相差太远所致．

本研究通过亲缘关系分析把嫩食型南瓜分为两个大类，分析结果显示，嫩食型南瓜品种间差异较明显，南瓜品种间遗传变异率较高．从聚类图可以看出，部分不同来源的一些种质资源聚在同一类群，其原因可能是由于栽培过程中相互引种，从而导致不同地区的种质资源亲缘关系较近．而有些(同一来源的)品种没有聚在一起，可能是由于本试验采用的ISSR分子标记太少，未能真实反映其亲缘关系．本试验结果说明，嫩食型南瓜种质资源具有较丰富的遗传多样性，有利于物种适应环境．因此，嫩食型南瓜引种时要充分考虑各种影响因素，才能更明确其亲缘关系，保持更为丰富的遗传多样性．