甲基化酶DNMT3B基因敲除的CHO-K1细胞系构建

陈奇娜，王 斌，郭 庆，王 静，黄 伟，王 霄，纪 华

(1.大理大学 药学院，云南 大理 671000；2.昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214；3.解放军联勤保障部队第920医院 肿瘤科，云南 昆明 650032)

DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)是在DNA序列的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基上加一个甲基的重要表观修饰酶，DNMT分为DNA甲基转移酶DNMT1和从头甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B[1]，DNA甲基化修饰可在DNA复制过程中经细胞分裂并遗传给下一代，这种修饰通常与基因沉默有关，被认为是构成性和兼性异染色质形成的重要因素[2]．此外，DNA高甲基化也被证明是用来维持基因的永久沉默[3]．因此，DNA甲基化被认为是转基因沉默[4]的重要原因．近年来，CHO-K1细胞越来越多地用于重组蛋白药物的生产，以及克服转基因沉默等以提高CHO-K1高效表达的手段而备受关注．因而，获得DNA甲基化缺陷并稳定高效表达的CHO细胞株已成为产业界追求的目标．

CRISPR/Cas9是用于基因编辑的前沿方法，以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景．例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病．此外，该技术的成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰[5-6]．通过设计含有20个核苷酸的sgRNA(small guide RNA)，并且sgRNA与核苷酸序列为 NGG 的PAM序列相邻；sgRNA和靶标DNA之间的互补碱基配对，sgRNA引导Cas9内切酶接近基因组中的任意DNA序列，Cas9-DNA的相互作用以及相关的构象变化驱动R-loop的形成和在靶向基因组DNA中进行双链断裂(DSB)．双链断裂后DNA修复机制启动并催化非同源端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)．对于NHEJ，丢失的序列可能无法恢复，导致序列插入或缺失，以及基因功能丧失．而对于HDR，引入外源DNA模板将填补DSB，从而进行基因敲入、删除、调整或突变[7-8]．

CHO细胞主要包括CHO-dxb11、CHO-K1、CHO-dg44和CHO-s等多种细胞系[9-11]．随着CHO细胞培养条件的不断改进优化，比如，改进培养温度、驯化贴壁细胞悬浮培养、无胎牛血清培养等，可以获得不同表观遗传背景的细胞系用于提高工业化生产中蛋白的表达量．虽然已有CHO-K1中甲基化酶基因DNMT3A、DNMT3B基因敲除后的报道[12-16]，但是，可能存在因为基因敲除靶点的区别、不同甲基化背景的CHO-K1细胞甲基化酶基因敲除后诱变条件的不同，导致表观遗传背景差别，以及获得的细胞系高效表达的潜质完全不相同，因此，筛选DNMT3B基因特异位点敲除的特异细胞系仍然很有必要．

本研究利用CRISPR/Cas9基因修饰技术，通过优化的软琼脂培养法对本实验室驯化培养的 CHO-K1 细胞进行靶向sgRNA设计、细胞筛选和阳性克隆鉴定等，以期得到具有高效表达潜力的DNMT3B基因特异位点敲除的CHO-K1细胞系．

1 材料与方法

1.1 靶向DNMT3B基因的sgRNAs设计

根据CRISPR/Cas9靶点设计原则[17-18]，设计大于20个核苷酸长度的sgRNAs[19]．同时选择DNMT3B基因第4个外显子3个不同的靶点序列(表1)，通过体外实验，从中筛选出效率较高的sgRNA，以增加成功率和增强敲除效率[8]，CRISPR/Cas基因敲除质粒构建示意图如图1所示．

表1 sgRNA设计序列

图1 CRISPR/Cas基因敲除质粒构建示意图

1.2 引物合成

根据实验要求设计DNMT3B基因第4外显子的检测引物(表2),引物由上海生工生物工程有限公司合成．

表2 引物序列

1.3 转染及嘌呤霉素筛选

采用脂质体转染，转染前2 d，将24孔板的培养基换成不含抗生素的血清．当细胞汇合度达到50%～70%，进行转染．转染效率最佳的为 10 μL 体系，转染试剂 3.6 μL，质粒 1.2 μg．步骤如下：加 3.6 μL 转染液到无抗生素培养基中，孵育 5 min；加 1.2 μg 的质粒到无抗生素培养基和转染液中孵育 20 min；24孔板换液 490 μL 无抗生素培养基；将孵育好的转染试剂和DNA转入细胞培养基中轻柔混匀．设置3个重复和阴性对照，荧光显微镜下观察3个重复转染效率相差不大，阴性对照没有荧光．转染 24 h 后加入 12 μL 的嘌呤霉素，培养 4 d．

1.4 单克隆筛选

本实验采用软琼脂法挑取单克隆．配置终质量分数为0.5%琼脂+10%FBS+1%三抗+1×DMEM的下层琼脂，以及终质量分数为0.35%琼脂+10%FBS+1%三抗+1×DMEM的上层琼脂铺板到 5 cm 的细胞培养皿中[20]．细胞经过细胞筛过滤以后，计数200个细胞加入上层琼脂中．

通常铺板 14 d 左右，肉眼可以观察到针尖样的单克隆细胞团，细胞铺软琼脂期间每隔2～3 d，往软琼脂中加入 200 μL 的培养基，避免软琼脂过于干燥．当肉眼能看到单克隆细胞团时，用镊子挑出单克隆到96孔板中将细胞团吹散．

1.5 TE1酶切

1.5.1 反应体系

T7E1核酸内切酶反应体系见表3．

表3 T7E1核酸内切酶反应体系

1.5.2 酶切反应程序

95 ℃ 5 min；95～85 ℃ -2 ℃/s；85～25 ℃ -0.1 ℃/s；4 ℃；置于PCR仪中反应结束后，加入 0.5 μL 的T7E1内酶，严格冰上操作；加入T7E1内切酶后，37 ℃ 反应 0.5 h 后，立刻跑电泳，电泳槽TAE每次换成新的．

2 结果与分析

2.1 单克隆细胞中DNMT3B基因的鉴定

2.1.1 DNMT3B基因片段鉴定

经过转染sgRNA的质粒，用嘌呤霉素筛选后，通过对获得的瞬时转染的细胞进行软琼脂法筛选，并对获得的单克隆进行DNMT3B基因鉴定，扩增片段大小为483 bp(图2)，确定为筛选引物扩增的目的片段．

2.1.2 基因敲除阳性细胞筛选

为了确认获得的单克隆是否发生基因编辑，利用T7E1酶切切割DNMT3B基因，而T7E1 核酸内切酶能够识别由于碱基缺失或改变造成不完全互补配对的杂合双链 DNA，进行DNA切割，对野生型则不会产生切割．如图3所示，1号、2号为DNMT3B-1单克隆T7E1酶切1号体系和2号体系(表3)切开的条带，7号、8号为DNMT3B-2单克隆T7E1酶切的1号体系和2号体系(表3)切开的条带，均切开3条条带．

M:Marker;1:DNMT3B-1，用DNMT3B引物扩增；2:DNMT3B-2，用DNMT3B引物扩增．图2 DNMT3B 基因片段PCR鉴定结果

图3 单克隆筛选酶切鉴定结果

随后，将T7E1酶切切开的PCR产物纯化后进行TA克隆，菌落PCR，阳性菌落扩大培养后，小提质粒，DNA测序比对，确定该单克隆基因敲除了25 bp(图4a)和敲除了10 bp(图4b)成功，并进一步通过比对，确定基因敲除位点发生在第4外显子上(图4c)．

2.2 DNMT3B基因特异位点的细胞筛选

基于上述基因鉴定结果，确定DNMT3B基因敲出背景清楚的单克隆，再通过有限稀释法对单克隆进行重筛选．分别获得DNMT3B第4个外显子上删除25 bp和10 bp的特异的细胞株，普通显微镜下显示细胞生长情况良好(图5a)．为进一步确定单克隆均一性，用倒置荧光显微镜进行分析其荧光均一度(图5b)．

图4 DNMT3B-1、DNMT3B-2单克隆测序结果

图5 DNMT3B-1、DNMT3B-2单克隆细胞

3 讨论

DNMT3B基因由23个外显子组成．本文通过CRISPR/Cas9基因修饰技术，分别获得DNMT3B第4个外显子上删除25 bp和10 bp的特异的细胞株．虽然已有利用CRISPR/Cas9基因修饰技术，将CHO-K1甲基化酶基因DNMT3B中第1个外显子上的一部分片段的基因敲除的报道[12]，但是该文与本文的基因敲除靶点完全不同，并且敲除的片段长度也不同，因而有可能对细胞的染色质三维结构层面，如开放染色质、染色质环、或染色质结构域[21]等造成不同的影响，导致获得基因敲除细胞的表观遗传背景可能完全不同．另外，不同甲基化背景的CHO-K1细胞经甲基化酶基因缺失后获得的细胞表观遗传背景也可能有差别．由于不同的表观遗传背景差异，不同的DNMT3B基因敲除的细胞系可能在筛选高效表达细胞系的潜质完全不相同．因此，本研究获得的DNMT3B基因特异位点敲除的特异细胞系仍然具有一定的创新性．

本研究所采用的CRISPR/Cas9方法在单克隆细胞的筛选上利用软琼脂法，不同于与已有报道[12-15]的DNMT3B、DNMT3A基因敲除研究中用到的流式分选或者96孔板稀释法．流式分选法的优点是省时省力，但与其他单克隆筛选的方法相比，费用较高，并且有容易污染、细胞膜容易受损等缺点．有限稀释法作为传统筛选方法，优点是技术成熟、操作简单、成本较低[22]；缺点是单克隆得率低．而软琼脂法操作简单、成本较低，并且得到的单克隆细胞均质性更好，但是生长环境完全不同于有限稀释法的96孔板，因此对获得的细胞的表观遗传背景也可能产生不同的影响．虽然获得的DNMT3B基因缺陷的单克隆细胞已经过严格的测序鉴定，并且荧光分析结果显示单克隆较为均一，但是，仍然需要对其进行进一步鉴定，并在后续应用于高效表达细胞筛选研究中对其表观遗传背景进行深入分析．