生物活性次生代谢产物在家禽饲养中的应用

查艳景，杨本寿，左 祥

(1.曲靖医学高等专科学校 基础医学学院，云南 曲靖 655000； 2.曲靖医学高等专科学校 微生物研究所，云南 曲靖 655000)

农业是我国经济发展的基础，而畜牧业作为农业经济的重要组成部分，受到国家有关部门的高度重视．据报道[1]，我国每年的粮食增长幅度有限，导致家禽饲料短缺，阻碍了畜牧业的发展，造成家禽产量需求与饲料供应之间形成了一种供需落差，因此饲料已成为影响家禽饲养的重要问题．而探讨生物活性次生代谢产物在家禽饲养中的应用是解决该问题的一种有效途径．次生代谢产物是植物适应生长环境的一种常规现象，也是植物、生物以及非生物因素等多种作物相互作用的结果[2]．目前，国外一些发达国家已经在生物活性次生代谢产物的研究领域取得了一定进展，且研究主要集中在生物产量、生物活性中的抗逆性和抗虫性等性状层面，并根据研究成果建立了相对应的资源档案和数据库[3]．

国内对生物活性次生代谢产物的研究起步较晚，最初是由我国的生物科研院所和农业科学研究院等一些机构开展研究．近年来，对于该领域的研究已经形成了一定规模．例如：文献[4]根据葡萄渣多酚抗氧化、抗菌和抗炎等生物特征，描述了葡萄渣多酚的生物活性作用，并分析了在生物生产上的应用[4]；文献[5]介绍了牛磺酸在生物血意义上的功能，主要是保护生物细胞以及保证生物的循环代谢等，同时总结了牛磺酸在家禽生产中应用场景[5]．目前，学术界对于将生物活性次生代谢产物应用到家禽饲养生产方面的研究内容还不够全面，需要深入探讨.

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

在家禽饲料价格不断上涨的背景下，新饲料资源逐渐成为家禽饲养的主要研究对象．为探讨生物活性次生代谢产物对家禽饲养的影响，试验以小麦叶片为研究对象，并进行试验测试．试验用药品和试剂如表1所示，器材见表2.

表1 药品与试剂

表2 仪器和器材

续表2

1.2 测定指标及测定方法

以小麦叶片作为生物活性次生代谢产物的试验样品，设置植物水分、粗蛋白质量分数、粗纤维质量分数、粗灰分质量分数、钙质量分数及磷质量分数作为试验指标[6]．

试剂配制过程：用电子天平称取33.05 g的磷酸二氢钠，定容至800 mL，静置15 min，生成0.15 mol的溶液，设定为溶液A；称取72.86 g磷酸氢二钠，定容至800 mL，静置10 min，生成0.15 mol的溶液，设定为溶液B．将25 mL的溶液A与75 mL的溶液B混合，再加入500 mL的蒸馏水与其充分混合，生成0.89 mol酸碱值为7.1的磷酸盐缓冲液[7]．取850 mL的清水，并将80 g的钨酸钠和40 g的磷钼酸溶解于水中，待充分溶解后再倒入容量为1.5 L的烧杯内，摇匀后加入 55 mL 的磷酸，再接入冷凝管，将烧杯放置在沸水浴上加热并回流1.5 h，待完全冷却后加500 mL的水并稀释，生成F-D试剂[8]．向磨口回流瓶中加入120 g钨酸钠和30 g钼酸钠．准备850 mL的蒸馏水、78%的磷酸、85～120 mL浓盐酸，用文火回流8.5 h[9]．然后将冷凝器取下，随后加入硫酸锂与蒸馏水混合摇匀后，再加入液体溴7～9滴．将蒸馏水煮沸，20 min后，观察并轻嗅溶液的颜色和味道，直至溶液从绿色变为黄色．若溶液中仍然呈现出绿色，根据绿色的鲜艳程度，重复上述步骤2～3次．待溶液完全冷却后，定容至1 200 mL，并将过滤后的溶液倒入避光瓶中保存[10].

指标测定：测定植物水分利用烘干法快速水分测定仪测定；粗蛋白质量分数用凯氏定氮仪测定；粗纤维质量分数用酸碱洗涤法测定，采用碳酸钠、氢氧化钠及高锰酸钾进行洗涤，去除植物溶剂降解产物，完成粗纤维测定．其余指标的测定方法如表3所示.

表3 测定指标及方法

称取10 g样品，倒入200 mL的烧杯中，再添加10%的三氯乙酸溶液80 mL，充分混合后静置 8 min，采用干过滤方法过滤溶液，去除初始滤液[11]．将滤液转移至离心管中，在4 200 r/min下，离心15 min，将上清液倒入消化管，进行粗蛋白质量分数测定．此外，还需检测样品中的粗纤维、粗灰分、钙、磷的质量分数[12]．并用下面的公式计算生物发酵物中的小肽质量分数，将小肽质量分数作为试验的参照指标，进行下一步骤．

(1)

式中：Q表示生物发酵产物中的小肽质量分数，单位为%；N表示盐酸的浓度，单位为mol/L；A1表示测定过程中，消耗的盐酸溶液的体积，单位为mL；A2表示测定过程中，空白试验所消耗的盐酸溶液的体积，单位为mL；e表示样品的粗蛋白质量分数，单位为%；l表示样品质量，单位为g．

1.3 提取并分离次生代谢产物

压缩滤液至黏稠状，利用等体积的石油醚脱油3～5次，再采取用等体积的乙酸乙酯萃取，重复3～5次后得到发酵液酯提浸膏的减压浓缩状态；待菌丝体阴干后，用乙酸乙酯超声提取2～3次；利用薄层色谱法(TLC)比较两部分浸膏的成分差异，检测后减压浓缩得到40 g的最终浸膏．提取流程如图1所示．

图1 次生代谢产物提取与分离流程

根据图1次生代谢产物的提取与分离流程，将提取、分离到的不同质量的化合物，进行TLC检测并加入碘粉和5%的硫酸乙醇溶液，得到最终的化合物.

1.4 计算样品生物活性

将小麦叶片培养12 h后，采用血球计数板法计数，用无菌液体培养基配制成含菌量为1×108的菌悬溶液．称量3 mg样品，配置成质量浓度为 2.2 mg/mL 的样品溶液[13]．然后利用无菌水分别稀释成浓度为10.25，22.50，50.00，75.00，100.00 μmol/L 的溶液，加入等量的菌悬液充分摇匀后，重复上述步骤，直至达到最小抑制浓度值．生物活性以清除生物有机自由基的能力为衡量标准，而这种生物有机自由基，外观呈现紫色，在波长为510～520 nm处能使颜色变淡直至褪色[14]，并且其接受电子与褪色程度之间呈现相应的定量关系．将5 mL的溶液与3 mL的 180 μmol/L 的甲醇溶液混合并摇匀[15]．保证室内 45 min 无光条件反应下，在510 nm处测定样品的吸光度值，并按照下面公式计算，则得到试验样品的生物活性数值．

(2)

式中：R表示清除DPPH的半数抑制率；X0表示 5 mL 甲醇与2 mL 180 μmol/L的DPPH的吸光度值；X1表示8 mL样品与2 mL 180 μmol/L的 DPPH 混合反应后的吸光度值；X2表示8 mL的样品与1 mL甲醇的吸光度值．

1.5 检测家禽饲料成分特征设定应用范围

饲料是家禽获取营养物质的主要来源，饲料的质量直接影响家禽的生长发育．因此，必须检测家禽饲料中的成分特征，并设定生物活性次生代谢产物在家禽饲养中的应用范围．通常情况下，家禽饲料中主要以植物的茎叶和籽实作为饲料的原材料．依据常规无菌操作流程，将次生代谢产物的试验样品洗净晾干后，用体积分数为70%的乙醇浸泡 1 min 后，再用无菌水漂洗3次，将其放置在无菌滤纸上吸干水分，备用．将植物叶片分割成 0.75 cm×0.75 cm的块状，并将其放置在含有氯霉素与链霉菌的新鲜培养基中．培养箱内的温度设置为25.5 ℃，3 d为1个周期，培养两个周期．培养结束后，对比家禽饲料的物质成分和试验样品的成分，得到检测结果．家禽饲料的主要成分如表4所示．

表4 家禽饲料的主要成分

由表4可知，家禽饲料的主要成分中，维生素B、脂肪和胡萝卜素质量分数较低．而在生物活性次生代谢产物中，除富含碳水化合物之外，还包括单糖、双糖以及半纤维素、纤维素以及淀粉等物质．此外，家禽饲料不仅受提取工艺的影响较大，饲料中的非脂固物质、挥发性脂肪酸的比例以及乳铁蛋白的质量分数还不同程度地受次生代谢产物的影响．

综上，根据家禽的品种等信息，将生物活性次生代谢产物应用到饲料制作过程中，通过提取并分离次生代谢产物、计算样品生物活性以及检测家禽饲料成分特征设定应用范围，则可得到试验结果．

2 结果与分析

在不同的质量条件下，测试生物活性次生代谢产物对家禽采食速率的影响，结果如表5所示．不同质量下次生代谢产物对家禽采食速率的影响详见图2．

表5 家禽采食速率均值

图2 不同质量下次生代谢产物对家禽采食速率的影响

从表5和图2可知，在相同的次生代谢产物质量条件下，分别对比家禽在3个时间段的采食速率，当次生代谢产物质量为50 g时，家禽在3个时段内的采食速率均值为50.81 g/h；而在25，75，100 g的质量条件下，家禽在3个时段的采食速率均值分别是21.25，43.57，42.47 g/h．表明当生物活性次生代谢产物质量为50 g时，家禽在3个时间段的采食速率均值均高出其他质量条件下的采食速率均值．由此得出，生物活性次生代谢产物质量为50 g时，最适宜应用到家禽的饲料制作中．

3 讨论与结论

1)由本试验结果可知，生物活性次生代谢产物与家禽饲料之间存在直接关联．当生物次生代谢产物质量为25 g时，其3个时段采食速率均值为21.25 g/h；当生物次生代谢产物质量为50 g时，其3个时段采食速率均值为50.81 g/h；当生物次生代谢产物质量为100 g时，其3个段采食速率均值为42.47g/h．由此可知，当生物活性次生代谢产物质量为50 g时，为制作家禽饲料的最佳应用方案．

2)探讨生物活性次生代谢产物在家禽饲养中的应用，不仅能提高家禽饲料的转化率，还能缓解粮食供求紧张的局面．除此之外，加入生物活性代谢产物的家禽饲料具有更高的营养价值，在一定程度上降低了饲养成本，提高了经济效益，有利于家禽饲养产业的发展．并为改善家禽饲养的生物条件提供了多元化的技术手段，具有较好的应用前景．但由于研究条件有限，对于生物活性次生代谢产物在家禽饲养中的应用，今后还需深入研究.