珍珠层用于成骨研究中的进展*

杨艳兰 徐普

珍珠层在人类医学上的应用由来已久。早在1931年考古学发现，玛雅人头骨中珍珠层制成的牙齿可以与周围的骨骼实现完美的结合［1］。而使用珍珠层作为骨移植替代物取得的重大突破是在1992年，Lopez［2］等人发现来自贝母珠的珍珠层同时具有生物相容性和骨诱导性。自此以后，珍珠层作为天然材料应用于骨组织工程的研究就倍受关注。

1.珍珠层的组成

珍珠层是一种有组织的有机-无机复合材料，由软体动物外套膜组织上皮细胞分泌的晶体前体（Ca2+和CO32-）和无定形碳酸钙，以及由蛋白质和多糖组成的有机基质分子［3］。

在化学成分组成上，珍珠层是由95%的无机碳酸钙和5%多种有机成分的无机-有机复合的结晶形式，无机碳酸钙有三种多晶型，即方解石、文石和球霰石。方解石是这些多晶中最具热力学稳定性的，而文石和球霰石则不稳定，在溶液中很容易分解为方解石［4］。热分解有机基质释放出的空间在很大程度上促进了珍珠文石的重构相变。而有机部分包括蛋白质、肽、糖蛋白、几丁质、脂类和色素的混合物［4］。迄今为止，已鉴定出50多种来自珍珠层的蛋白质和50种肽，有机分子可以用水和有机溶剂如乙醇来萃取，可以提取为水溶性基质（Water Soluble Matrix，WSM）、酸溶性基质（Acid Soluble Matrix，ASM）和酸不溶性基质（Acid Insoluble Matrix，AIM）［5-7］。虽然珍珠层中的有机基质只有5%的重量，但它在晶体成核、生长空间、化学控制、微观结构和韧性增强等方面起着重要作用。

2.珍珠层的机械性能

珍珠层是一种天然复合材料，由碳酸钙晶体包裹在有机基质中形成的高度有组织的“砖混”或“砖墙”微观结构组成［8，9］。在“砖墙结构”中，文石片和有机基质薄片交替排列，文石片为堆叠的“砖墙”，有机大分子为“砂浆”，文石片和基质的分层组装结构赋予了珍珠层优异的拉伸强度和韧性［5，8］。巧妙的结构设计同时赋予珍珠层优秀的强度和断裂韧性协同作用，从而使珍珠层复合材料具有优越的力学性能。精确几何排列是珍珠层稳健力学行为的重要原因之一，这种特殊的微结构赋予了比地质文石更高3000倍的抗断裂能力，蛋白质是无机纳米颗粒之间的强力胶，蛋白质与文石纳米颗粒之间的强静电相互作用以及蛋白质的高塑性是矿物-蛋白质复合材料高断裂韧性的主要原因［10］。珍珠层的断裂韧性为3.3-9兆帕，它大约是整体文石的3到9倍［11］。珍珠层的杨氏模量或弹性模量分别为30-40gpa和20gpa，而骨的分别为185-200mpa和140mpa［12，13］。

然而，只有砖混结构不足以解释珍珠层的力学性能。此外，还有微米和纳米级结构特征，如微观显示一些文石片燕尾状特征即相邻片剂之间的联锁和文石片的波纹会产生额外的抗片剂滑动的阻力［14］。纳米尺度上显示，纳米微凸体、矿物桥和珍珠母的矿物片剂的波状几何结构已被证实在机械性能方面起增强作用［8］。

由于珍珠层优越的力学性能，常被加工制备成具有适当生物力学特性的矫形器械，如钢板或螺钉［15］。除骨组织工程外，珍珠层非凡的机械性能激发了研究者们开发模拟珍珠层的合成纳米复合材料，如珍珠层结构样陶瓷材料。珍珠层的仿生结构也应用于复合材料、涂层、薄膜，其中珍珠层模拟纸具有轻质、形状持久、优异和可调的机械性能以及隔热和防火性能［16-18］。

3.生物相容性

研究显示，人类骨髓基质细胞中加入WSM后细胞的形态没有发生改变，没有观察到细胞的死亡和或凋亡情况［19，20］。珍珠层的乙醇可溶性基质（Ethanol Soluble Matrix，ESM）的提取物利于MC3T3-E1的增殖、分化，也证明其在体外细胞有生物相容性［21］。

珍珠层植入物的体内实验也证实了其较好的生物相容性［1］。Libouban［15］用珍珠层制备直径3.5mm骨科螺钉，将螺纹螺钉植入绵羊胫骨上端干骺端，结果显示在3个月和6个月均没有出现局部炎症反应。Rousseau［22］将绵羊模型膝关节软骨下区放置珍珠层块，三个月后观察未见植入处有炎症反应。

4.珍珠层用于成骨实验的效果

4.1 体外成骨 研究显示，珍珠层的表面形态特征有利于成骨，将其复制到聚己内酯上，检测骨骼干细胞在聚己内酯的成骨能力，结果显示珍珠质表面的骨骼干细胞面积增加，成骨标记物碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）和骨钙蛋白（Osteocalcin，OCN）表达增加［23］。

通过不同方法从珍珠中分离出的可溶性有机基质能够刺激各类骨细胞的分化和增殖以及生物矿化。David［19］等研究发现用珍珠层培养的人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells，hBMSCs）比用最有效的骨诱导因子（Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2，rhBMP-2）治疗时产生更强的骨诱导分化反应。

珍珠层除了成骨分化、增殖，还促进成骨细胞矿化。珍珠层还可诱导下颌骨来源的人骨细胞（Human Bone Cells，HBCs）合成更多的骨基质矿化标志物骨唾液酸蛋白（Bone Sialic Acid Protein，BSP）［24］。珍珠层乙醇溶性基质（ESM）可促进骨关节炎患者成骨细胞矿化能力。研究显示100μg/ml ESM处理OA成骨细胞14d后，茜素红染色显示成骨细胞中存在钙沉淀，而200μg/ml只需要7d。扫描电镜拉及曼光谱表征均显示ESM处理后有磷酸盐纳米颗粒，qPCR检测高剂量的ESM比低剂量的ESM能更快、更持久地刺激成骨标志物ColⅠ、骨桥蛋白、骨钙素和Runx2基因表达［21］。

4.2 体内成骨 不仅体外，珍珠层可以促进体内成骨。在过去几十年中，珍珠层被设计成可棒状、滑车状、螺钉和钢板，粉末状包括微米级、纳米级，以满足骨科的临床需要。并在不同体内的不同植入部位进行了不同用途的测试。研究显示珍珠层的种植部位几乎包括所有的骨质，有上颌骨、下颌骨、股骨中段或股骨骨骺、第一跖骨、腰椎或横突之间，均可以促进大鼠、绵羊、兔和猪缺损处新骨的形成［25-29］。

在骨缺损临床治疗方面，Atlan［30］等人将珍珠层粉与8名上颌骨丢失患者的血液混合成泥浆，将泥浆注入上颌骨缺失的组织中。6个月后，活检显示珍珠层已被局部组织接受，微观显示新形成的骨紧密地焊接到珍珠层颗粒上，没有软组织或纤维组织镶入，成骨细胞被激活，新的健康骨在整个植入物中形成，而珍珠层颗粒慢慢地逐渐向心溶解，被未成熟的编织骨和成熟的板层骨取代。

在骨质疏松方面，Kim［31］通过切除雌鼠双侧卵巢（ovariectomized，OVX），制作其胫骨近端骨质疏松模型，术后3d开始，每天口服WSNF 25mg/kg，连续30d。CT结果显示口服WSNF组骨密度（Bone Mineral Density，BMD）、骨体积占总骨体积的百分比（trabecular bone volume as a percentage of total bone volume，BV/TV）和 骨 小 梁 数 目（Trabecular Number，Tb.N）较空白对照组明显增高；钙黄绿素双标记法显示骨矿化沉积率（Mineral Apposition Rate，MAR）和 骨 形 成 率（Bone Formation Rate，BFR）较对照组增高；苏木精-伊红染色检测显示，每毫米骨小梁表面的成骨细胞（Numbers of Osteoblasts，NOb）增多而破骨细胞（Numbers of Osteoclasts，NOc）减少。这表明珍珠层粉可以预防OVX诱导的小鼠骨丢失所致的骨质疏松。

4.3 珍珠层成骨的成分 珍珠层具有良好的成骨潜力，但珍珠层为复杂的混合物，而且有成骨效果的可溶性有机基质蛋白质成分构成复杂，成骨的活性分子的化学特性仍然未知。已有许多研究通过不同的方法萃取及鉴定提取物中的成骨活性成分，如水溶性基 质（WSM）［32］、纯化蛋 白PFMG3［33］、N16［34，35］、P10［36］、P60［37］、三种gigasin-2亚型和半胱氨酸蛋白酶抑制剂A2［38］。另外，珍珠母似乎含有分子量不同的蛋白酶抑制剂，这可能有助于保存对矿化等过程起重要作用的蛋白质［35］。目前这些单一蛋白对成骨是否有协同作用，有待于进一步研究。

除了蛋白，Ammar等［39］发现珍珠层的脂质（Lipids extracted from Nacre，LN）诱 导MC3T3-E1成骨细胞参与激活骨组织特定基因的启动子，如Col1a1、Bglap、Spp1和Runx2，与成骨前分化密切相关，还具有调节骨矿化和潜在骨沉积的作用。

除此之外，珍珠层被认为含有不明的可扩散的生物活性因子，这些生物活性因子能够通过刺激种植区附近成纤维细胞中细胞外基质蛋白的合成来启动成骨，而这些因子的成分有待于进一步研究。

5.珍珠层有效成分的促成骨机制

5.1 珍珠层中的N16抑制RANKL减少破骨细胞骨吸收促进骨的形成 骨不断经历复杂的重塑，以取代旧骨，保持骨骼的质量。破骨细胞吸收骨量，成骨细胞在吸收过程中产生新骨。核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator Of NF-KB Ligand，RANKL）有助于促进破骨细胞的成熟，提高破骨细胞对骨基质的吸收。RANKL通过与破骨细胞的受体，受体激活剂结合，对于破骨细胞的形成、融合、活化和存活是必不可少的［40，41］。研究显示单一的珍珠蛋白N16显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨细胞分化，减少多核破骨细胞的形成、肌动蛋白环数目和大小，抑制破骨细胞对成骨的吸收，促进成骨，且抑制作用随N16浓度的增加而增强［34，35］。

5.2 珍珠层通过JNK信号通路调控Fra1蛋白表达促进成骨细胞矿化c-Jun-NH2末端激酶（C-Jun N-Terminal Kinase，JNK）活化对于成骨细胞前期分化至关重要［42］，Fos相关抗原-1（Fra-1）为参与骨基质形成的必需转录因子［43］，二者活性增强可以促进成骨细胞分化。WSNF可以促进JNK的磷酸化进而增强JNK活性；WSNF还可以增强Fra-1的活性，而Fra-1是JNK信号的下游靶点，这些表明，JNK-Fra-1轴的激活可能在WSNF对成骨细胞矿化过程的刺激作用中发挥中心作用［31］。

5.3 珍珠层通过Bcl-2促进成骨细胞增殖Bcl-2蛋白存在于有丝分裂细胞核的染色体中，并与细胞周期相关。研究显示WSM可以诱导成骨细胞胞浆中Bcl-2含量明显增加，从而延长成熟成骨细胞的寿命；WSM可能通过一些细胞内机制，导致过量Bcl-2蛋白从细胞质运输到细胞核；WSM还可通过Bcl-2调节细胞的转录活性，并通过Bcl-2抗凋亡作用促进成骨细胞增殖［44］。

5.4 珍珠层通过抑制破骨细胞组织蛋白酶K减少骨吸收的作用促进成骨 组织蛋白酶K主要存在于破骨细胞中，是破骨细胞分泌的主要半胱氨酸蛋白酶，并在骨吸收过程中对降解骨基质蛋白起重要作用［45］。珍珠层有机基质中含有组织蛋白酶K抑制剂。以从珍珠层中提取的WSM为载体，在牛皮质骨片上培养兔破骨细胞，通过定量测定牛骨片上破骨细胞的吸收表面积，测定破骨细胞的吸收活性。研究发现，WSM在不影响破骨细胞存活的情况下降低了骨吸收，连续透析分离发现，分子量大于1000da和500-1000da的低分子量WSM作用最强，在WSM浓度增加的情况下，人组织蛋白酶K活性呈剂量依赖性抑制［46］。

5.5 珍珠层通过抗氧化促进成骨分化 自由基与许多生物分子如脂类、蛋白质和核酸发生反应并对其造成损害［47］。研究发现，WSM以剂量依赖的方式清除自由基并促进MC3T3-E1细胞分化［48］。

综上所述，珍珠层是一种有机基质与碳酸钙耦合结构的天然生物材料，由软体动物产生，具有许多利于成骨的优异特性，是一种天然的、多用途的骨移植替代材料。通过对其结构特性、机械强度、良好的生物相容性和成骨能力等性能的综述，可以认为，珍珠层作为骨替代材料的生理特性和生物学特性合适，有作为骨移植材料的应用前景。