IL-21、IL-17在IgA肾病的表达与TNF-α、TGF-β及病理分级的关系

曹 丽，鄂 静，李 晶，肖红燕，马丹娜 ，郑亚莉

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是亚洲人群最常见的原发性肾小球肾炎，临床及病理表现多样，是导致终末期肾病(ESRD)的主要原因之一[1-2]。白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-17(IL-17)是新近发现的白细胞介素家族两个重要的细胞和炎症因子。研究发现，IL-21、IL-17同处一个自分泌环，均受T辅助细胞17(Th17)分泌和调控，与IgAN起病及进展存在诸多关联[3]。本研究通过观察IL-21、IL-17在IgAN血清和肾组织中的表达及与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、病理分级之间的关系，来探讨IL-21、IL-17与IgAN免疫炎症活动和疾病进展的相关性，为寻找评估IgAN免疫炎症活动的生物标记物，指导临床合理治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料：IgAN组：纳入我院2018年10月-2020年6月经肾穿刺活检首次明确诊断为IgAN的患者73例，其中男性52例，女性21例，平均年龄(37.8±13.1)岁。排除其他急慢性肾炎，合并有糖尿病、高尿酸血症、高脂血症等代谢性疾病，合并有自身免疫系统性疾病、感染性疾病、肝病、肿瘤和六个月内曾服用或正在服用糖皮质激素或免疫抑制剂的患者。正常对照组：我院泌尿外科既往无任何疾病，因肾外伤行肾切除患者40例，其中男性28例，女性12例，平均年龄(35.6±11.2)岁。2组患者一般情况差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

血清及肾组织标本：收集2组患者清晨空腹静脉血，离心后收集血清，分装保存于-80 ℃冰箱待检；收集IgAN患者肾穿刺组织标本，分别用无菌盐水纱布包裹，分装PVC管密封冰盒转运至-80℃冰箱保存。其中IgAN组收集到肾组织标本17例，正常对照组收集15例。标本收集前已征得患者本人及家属同意，并经医院伦理委员会审查通过(伦理审批编号：2020-KY-118)。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂:IL-21、IL-17 ELISA检测试剂盒购自Abcam公司(ab119542、ab100556)，RNA裂解液Trizol试剂购自Invitrogen公司(#15596026)，总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司(#DP419)，逆转录cDNA试剂盒购自Takara公司(#RR036A)，SYBR荧光染料购自Takara公司(#RR820A)。IL-21单克隆抗体购自Abcam公司(ab5978)、IL-17单克隆抗体购自Abcam公司(ab79056)、TNF-α单克隆抗体购自NOVUS公司(NBP1-19532SS)、TGF-β单克隆抗体购自Santa cruz公司(sc-130348)，DAB显示试剂盒(ZLI-9018)、通用二步法检测试剂盒(PV-9000)、正常山羊血清(ZLI-9022)、苏木素染色液(ZLI-9610)均购自北京中杉金桥公司。

1.2.2 ELISA法检测2组血清IL-21、IL-17的表达:2组备用血清样本恢复至室温，按照ELISA检测试剂盒的操作步骤，将已制备的标准品工作液和血清待测样品分别加入已包被抗体的96孔板中，每孔100 μL，且重复做两个复孔(若样本浓度高于检测范围，需用样本稀释液稀释后取样)，酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min；弃去孔内液体，甩干后每孔加入生物素化抗体工作液100 μL，酶标板覆膜，37 ℃温育1 h；洗板：甩尽孔内液体，每孔加入洗涤液250 μL，浸泡1～2 min，吸去或甩掉酶标板内液体，在厚的吸水纸上拍干，重复此洗板步骤3次；加入酶结合工作液100 μL，加盖覆膜37 ℃温育30 min；弃去孔内液体，甩干，按照上述洗板步骤洗板5次；加入底物溶液(TMB)90 μL，覆膜后37 ℃避光孵育6 min；加入终止液50 μL终止反应；立即用酶标仪在波长450 nm处测量各孔的光密度值(OD值)。

1.2.3 荧光定量PCR(RT-PCR)检测2组冰冻肾组织IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-βmRNA 的表达：将储存于-80℃冰箱的肾组织标本解冻，在研磨碗中加入1 mL RNA裂解液(Trizol)充分研磨组织呈粉末状，将液体收集至1.5 mL无酶EP管中，加入200 μL氯仿剧烈振荡，使其充分乳化，室温静置5 min，4 ℃ 12 000 rpm离心15 min。出现分层现象后吸取上清至新的EP管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀，静置5 min，4 ℃ 12 000 rpm离心20 min。弃去上清保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，7 500 rpm离心5 min，弃上清后放置超净工作台中使乙醇挥发干燥，根据沉淀量加入适当的灭菌超纯水溶解RNA沉淀。65 ℃金属浴作用5 min促使沉淀完全溶解，涡旋混匀后上机检测RNA的浓度和纯度。利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，置于-80℃冰箱长期保存备用。以cDNA作为模板，PCR扩增检测，反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。利用2-△△Ct方法计算各基因mRNA的相对表达量。

1.2.4 免疫组化法(IHC)检测IgAN组肾组织中IL-21、IL-17、TNF-α的表达：将石蜡包埋的IgAN患者肾组织标本切成厚度为3 μm的切片，放入100%二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各作用10 min，常规脱蜡后依次放入梯度酒精中各作用5 min，自来水清洗干净。微波炉中加入柠檬酸钠抗原修复液对切片进行抗原修复处理，PBS冲洗切片后将其放入3% H2O2溶液中室温作用10 min，阻断内源性过氧化物酶活性。PBS缓冲液清洗3次，滴加山羊血清封闭液室温封闭1 h，去除非特异性背景染色。弃去封闭液，滴加适量的一抗释稀液：抗IL-21单克隆抗体(1∶100，Abcam)、抗IL-17单克隆抗体(1∶100，Abcam)、抗TNF-α单克隆抗体(1∶50，NOVUS)，4 ℃孵育过夜。去除一抗后滴加100 μL反应增强液，室温孵育20 min,PBS溶液清洗后滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG二抗聚合物溶液，室温孵育2 h，促使抗原抗体发生特异性结合。PBS缓冲液清洗,加入适量新鲜配置的DAB显色液,显微镜下观察染色程度,适时终止染色反应。自来水冲洗后将切片放苏木素杂色液中作用30 s，盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗反蓝。梯度酒精脱水、二甲苯透明，晾干后中性树胶封片。

2 结果

2.1 2组患者血清中IL-21、IL-17的表达：与正常对照组(Control组)相比，IgAN组患者血清中IL-21、IL-17表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 2组患者肾组织中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β的表达:与Control组相比，IgAN组肾组织中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)。

2.3 IgAN组肾组织IL-21、IL-17与TNF-α、TGF-β之间的相关性: IgAN组肾组织中IL-21表达与TNF-α呈正相关(r=0.895，P<0.05)；与TGF-β没有相关性(r=0.405，P>0.05)。IL-17表达与TNF-α呈正相关(r=0.677，P<0.05)，与TGF-β没有相关性(r=0.096，P>0.05)，见表1。

2.4 免疫组化法检测2组肾组织中IL-21、IL-17、TNF-α的表达:对照组IL-21、IL-17、TNF-α表达呈阴性，IgAN组IL-21、IL-17、TNF-α表达呈阳性，主要定位于肾小管上皮细胞，肾小球细胞中基本不表达，且IL-21、IL-17、TNF-α随病理分级加重,表达强度逐渐升高，见图1(封三)。

3 讨论

CD4+T细胞亚群的主要效应细胞Th17所介导的免疫炎症反应和慢性肾炎及IgAN的起病及进展已广受关注[4]。已有研究显示，Th17及其主要效应因子IL-17可通过调控核转录因子NF-kB信号通路参与并加剧免疫炎症反应,导致肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞损伤，肾功能恶化[5]。Zeng R等研究也发现，Th17可分泌和调控IL-21，IL-21通过JAK-STAT3信号通路诱导肾脏上皮细胞和成纤维细胞增殖，促进炎症反应和肾组织纤维化的形成[6]。同处Th17分泌和调控的自分泌环中的IL-21、IL-17一旦激活可相互协同，相互促进，并逆向激活加速Th17增殖和分化，共同参与和促进免疫系统疾病的发生和进展[7-8]。我们前期的研究中也发现[9]，IL-21、IL-17在IgAN患者血清中表达与蛋白尿、肾功能、血尿酸呈正相关，提示IL-21、IL-17可能参与IgAN临床免疫炎症活动的发生。本研究显示，IgAN患者血清及肾组织中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β表达均较对照组明显升高，且IL-21、IL-17表达和传统的对炎症刺激反应最快，产生最早的促炎因子TNF-α呈正相关，与TGF-β没有相关性，表明IL-21、IL-17可能和IgAN患者炎症反应关系密切，尤其可能和IgAN患者的早期炎症反应相关。

TGF-β是传统的免疫稳态炎症调控因子和纤维化因子[10]，正常生理情况下，当机体存在异常免疫炎症反应时，激活T调节细胞(Treg)分泌TGF-β发挥负向免疫稳态调控作用，防止免疫反应过激。但当调控失效，免疫炎症反应持续存在时，TGF-β则反向激活Th17并介导其下游炎症因子IL-21诱导B淋巴细胞持续转分化为IgA型浆母细胞，促进成纤维细胞增殖分化，导致IgAN肾小管萎缩，肾间质纤维化，肾功能恶化[11-12]。以上研究结果说明TGF-β可能是较为晚期的免疫炎症调控因子，当免疫炎症反应过激时最终以纤维化形式终止炎症反应。本研究结果中IL-21、IL-17的表达与TNF-α呈正相关，与TGF-β没有相关性，进一步通过免疫组化技术检查显示尽管肾小球未发现IL-21、IL-17、TNF-α的表达，但在肾小管上皮细胞均呈阳性表达，且病理分级越高表达越强，由此验证了既往研究结果，也从侧面说明IL-21、IL-17可能是较早期敏感的评估IgAN免疫炎症活动的生物标志物。

IgAN的病理显示主要为肾小球病变，本研究未发现IL-21、IL-17、TNF-α在肾小球表达，可能和其信号通路有关。在后续研究中我们将进一步扩大样本量，增加研究方法，并结合其他基础研究寻找其作用的信号通路深入探讨IL-21、IL-17和IgAN免疫炎症活动的关系，为后续寻找评估IgAN炎症活动生物标志物奠定基础。