微小RNA在胆管癌发生发展中的作用

陈 圣， 陈国想， 何中明， 程树杰， 赵继森

1 河北大学附属医院 肝胆外科， 河北 保定 071000； 2 西南医科大学 基础医学院， 四川泸州 646000

胆管癌是指来源于胆管黏膜上皮的一类恶性肿瘤，是最常见的原发性胆道恶性肿瘤。根据胆管癌出现的不同解剖位置分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌及远端胆管癌，后两者以前通常称为肝外胆管癌[1]。在过去的几十年中，全球范围内胆管癌的发病率逐渐增加，约占消化道肿瘤的3%[2]。原发性硬化性胆管炎、肝硬化及肝吸虫感染、胆管结石和Lynch综合征是已知的胆管癌的危险因素[3]。由于缺乏典型的早期临床症状和敏感的诊断指标，大部分胆管癌患者通常在治疗方式选择受限制的晚期被确诊。目前外科根治性切除手术仍是胆管癌患者治疗的最佳选择，但超过65%的患者因肿瘤大小、转移及淋巴结浸润等原因无法行手术治疗。虽然辅助性放疗、化疗及靶向治疗等治疗方式对胆管癌有一定作用，但患者的整体预后仍不容乐观，肝内胆管癌的5年生存率仅2%～15%，肝外胆管癌为2%～30%[4]。因此，阐明胆管癌的分子发病机制对于提高胆管癌的早期诊断及改善预后可能至关重要。随着研究的不断深入，越来越多的证据表明微小RNA(microRNA，miRNA)在胆管癌发生、发展的病理生理过程中扮演着重要的角色。因此，本文将miRNA在胆管癌中的研究进展进行总结，对其与胆管癌的恶性生物学行为的影响进行探讨，以期从miRNA的角度为了解胆管癌提供新的视角。

1 miRNA 简介

成熟的miRNA是一类小的、高度保守的、内源性非编码单链RNA，长度为20～22个核苷酸序列[5]。它们在转录后水平通过调节mRNA稳定性或影响翻译从而对后生动物靶基因表达发挥负调控作用。单个miRNA可以调节200多个mRNA[6]。1993年Victor Ambros及其团队提出第一个miRNA，描述了miRNA lin-4作用于靶基因lin-4 mRNA进而调控秀丽隐杆线虫的胚胎后发育[7]。随后，miRNA逐渐成为人们关注的热点，越来越多的研究证实其在脊椎动物和人类的生理病理过程中发挥作用。目前为止，大约700种miRNA在机体内被发现，可作为多种生物学过程中的关键调控因子。

2 miRNA 在胆管癌中的发生发展的作用

随着分子生物学技术的进步和miRNA调控疾病发生发展机制研究的不断深入，其异常表达与胆管癌的关系渐渐被发现。目前，在胆管癌组织与正常胆管组织中发现了许多差异表达的miRNA，部分差异表达的miRNA被视为是胆管癌发生、发展的重要调控因子。Meng等[8]第一次通过微阵列技术分析正常胆管细胞与恶性胆管细胞之间存在多种表达持续改变的miRNA。部分miRNA表达的改变可以反映肿瘤细胞遗传学异常，影响肿瘤的细胞周期、增殖、凋亡、炎症及肿瘤微环境。

2.1 miRNA参与细胞周期、增殖及凋亡 细胞凋亡信号下调、细胞周期发生紊乱、细胞增殖失控是肿瘤发生的重要机制，很多miRNA与这些异常存在密切联系。具有抑癌或促癌特性的多种miRNA在细胞中协同发挥作用以促进细胞表型的改变。Zhang等[9]发现在胆管癌组织和细胞中miR-30a-5p表达均显著增高，其表达水平影响胆管癌细胞增殖及凋亡，证实细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)是miR-30a-5p的靶基因。SOCS3是JAK/STAT信号通路的活化剂的负反馈调节因子。miR-30a-5p通过抑制SOCS3表达，负调控SOCS3信号传导促进胆管癌细胞的增殖。有研究[10]表明，miR-885-5p的过表达通过直接抑制GALNT3表达和间接下调IGF2BP1表达来抑制胆管癌细胞转移及增殖，同时miR-885-5p通过抑制GALNT3进而调控PI3K/AKT/MMPs通路来抑制胆管癌转移。Bcl-2是一种重要的癌基因，通过抑制促凋亡蛋白的激活来抑制凋亡，对胆管癌的发生有重要影响[11]。Yu等[12]通过对胆管癌组织与正常胆管组织对比分析发现，miR-612在胆管癌组织中的表达降低，在胆管癌细胞中沉默miR-612的表达可以上调靶基因Bcl-2表达，促进胆管癌细胞的增殖与侵袭。上述研究表明部分失调的miRNA参与调节胆管癌细胞的增殖、凋亡过程，这些miRNA可能是胆管癌潜在的治疗靶点。

细胞周期紊乱是肿瘤细胞的基本特性之一。miRNA可以调节多种细胞周期相关因子的表达，其表达水平的改变可能直接、间接导致细胞周期发生紊乱。Chang等[13]研究发现，miR-551b-3p在胆管癌中低表达，miR-551b-3p通过下调CCND1(一种G1-S周期调控基因)诱导G1期细胞周期停滞和细胞凋亡来抑制胆管癌的进展。研究表明，miR-494在胆管癌中呈低表达状态，可以诱导许多涉及细胞周期进展的基因失调，是胆管癌细胞生长的负调节分子。如miR-494过表达可以通过下调WDHD1的表达，抑制胆管癌细胞活力、阻止细胞周期进程，促进体内胆管癌细胞凋亡[14]。miR-494也可以通过抑制CDK6、CDK4等多个细胞周期相关靶基因的表达，导致胆管癌细胞在G1/S周期停滞[15]。还有研究[16]表明，miR-494可以调控6个G2/M过渡基因，诱导G2/M细胞周期阻滞。这些研究表明miRNA在胆管癌细胞周期中起着重要的调节作用，为胆管癌发病机理研究提供了新的视角，可能成为胆管癌治疗的候选靶标。

2.2 miRNA参与肿瘤侵袭和转移 局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性，是导致患者死亡的主要原因之一。侵袭是指肿瘤细胞沿组织间隙侵犯和浸润周围组织进入循环系统的过程，转移是肿瘤细胞侵袭后在其他组织器官形成继发性癌症的过程。两者是肿瘤进展过程中的不同阶段。许多研究表明miRNA的表达失调与胆管癌的侵袭与转移有关，如miR-137[17]、miR-21[18]、miR-24[19]、miR-34a[20]。在肝内胆管细胞癌，miRNA-129-2-3p表达明显降低，通过其靶基因Wip1抑制肝内胆管细胞癌的增殖和侵袭[21]。在肝外胆管细胞癌中，miR-451a和miR-144-3p显著低表达，可通过抑制胆管恶性肿瘤发生过程中的ATF2来减弱细胞迁移[22]。

2.3 miRNA参与胆管癌发展中的上皮-间质细胞转化(EMT)过程 EMT是调节细胞从上皮向间充质状态转化的过程。EMT被认为是癌症进展和转移中的前期与核心步骤。目前研究[18，23-24]表明，miRNA可以通过调控EMT过程参与胆管癌的发生。在这个过程中，miRNA影响N-钙黏蛋白、波形蛋白以及E-钙黏蛋白等EMT标志物的表达水平。如Zhang等[25]发现在胆管癌细胞系中过表达的miR-186可以使E-钙黏蛋白表达显著增加，而N-钙黏蛋白和波形蛋白表达减少。通过荧光素酶测定证实Twist1 (一种EMT诱导转录因子) 是miR-186的直接靶基因。miR-186通过靶向Twist1抑制胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT过程。实验[26]表明，miRNA-329也可以抑制EMT过程，当过表达miRNA-329时，波形蛋白和N-钙黏蛋白减少而E-钙黏蛋白表达增强。miR-424-5p参与肝内胆管细胞癌的EMT过程，过表达的miR-424-5p可以上调E-钙黏蛋白并下调N-钙黏蛋白和β-钙黏蛋白。进一步研究[27]发现，miR-424-5p通过与靶基因ARK5 mRNA的3′-UTR结合，抑制mTOR磷酸化，从而抑制肝内胆管细胞癌的EMT过程。ARK5是人类AMP激活的蛋白激酶(AMPK)家庭的新成员，研究[28-29]发现，ARK5的表达在多种癌症的转移和侵袭中起着重要作用。miR-494过表达可增加E-钙黏蛋白的表达，而N-钙黏蛋白、波形蛋白、Twist和MMP-9的表达则降低[30]。在测定了20例胆管癌患者的肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中上皮-间充质标记物的表达水平后，Zhang等[31]发现上皮标记物E-钙黏蛋白和miR-200b低表达，间充质标记物纤维黏连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)高表达，转录因子AP-2α和丝裂原活化蛋白激酶7(mitogen-activated protein kinase 7，MAPK7)被鉴定为miR-200b的靶基因，随后在小鼠模型中miR-200b的过表达可以抑制肿瘤形成和EMT减少。这些研究表明，在胆管癌发展中miRNA间接或者直接调控EMT可能是常见且至关重要的现象。EMT是胆管癌发生侵袭和转移的主要机制之一。miRNA广泛参与EMT的过程，可通过改变癌组织中miRNA的表达，逆转EMT过程，抑制胆管癌转移，改善胆管癌患者预后。但是，目前miRNA调控EMT的确切机制尚需进一步研究。

2.4 miRNA调节胆管癌中炎症反应 炎症反应是免疫反应的一部分，可消除引起机体细胞损伤的病原微生物并促进组织修复[32]。然而，长期反复的慢性炎症刺激会增加组织癌变的风险。胆管细胞的恶性转化被认为与胆道上皮的慢性炎症有关[33]。损伤的胆管中存在高水平的促炎细胞因子是导致胆管癌进展的原因之一[34]。胆道炎性微环境中IL-6的浓度升高可能刺激多种致癌信号通路，如ERK、JAK-STAT和PI3K通路[35]。研究[36]发现，对于胆管癌患者来说，其胆道微环境及体循环中IL-6表达水平均增加，并在肿瘤生长中起重要作用。

研究证实，不管是自分泌还是外源性IL-6刺激均能改变机体内miRNA的表达情况。Meng等[37]发现miRNA let-7的上调有助于胆管恶性肿瘤细胞中依赖IL-6的信号转导和STAT3的激活。这是首次发现miRNA在慢性炎症和胆道恶性肿瘤中发挥作用。Lin等[38]通过高通量测序发现胆管癌患者let-7c、miR-99a和miR-125b均被下调，进一步实验发现，let-7c/miR-99a/miR-125b的过表达通过靶向IL-6/STAT3炎症通路的重要细胞因子，进而抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭。此外Meng等[39]发现IL-6通过miR-370的表达来促进胆管癌的生长。An等[40]随后证实了这一结果。Ishigami等[41]通过体外实验证实，外源性IL-6可以以剂量依赖性方式显著上调胆管癌细胞系中miRNA-31表达和促进癌细胞的增殖，进一步研究发现，miRNA-31表达受IL-6/STAT3信号通路调节。这些研究强化了炎症微环境、表观遗传学与胆管癌发生的分子机制之间相互作用的生物学基础，同时也为靶向控制炎症反应的miRNA提供了理论基础。

2.5 miRNA调节肿瘤微环境 胆管癌典型的组织学特征是纤维增生，即大量的反应性纤维化间质包围并浸润肿瘤组织，由此形成复杂的肿瘤微环境[42]。肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是实体瘤肿瘤微环境中较丰富的细胞之一，也是胆管癌中促进肿瘤纤维形成和最有可能导致肿瘤进展的主要细胞[43]。NcRNAs也可以调节肿瘤微环境中除肿瘤细胞外其他细胞中基因的表达[44]。研究发现，在由胆管癌组织分离的CAF中miR-15a和miR-148a的表达较正常皮肤成纤维细胞显著下调。此外，miR-15a抑制纤溶酶原激活物抑制物-2的表达，促进胆管癌细胞的迁移[45]。在多种癌症相关的纤维细胞中miRNA-148a存在下调，CAF中过表达的miR-148a 通过直接靶向Wnt10B(wnt蛋白家族成员之一)影响肿瘤的生物学表型[46-47]。这些研究表明miRNA在促进CAF形成、影响肿瘤微环境、进而参与调节胆管癌进展中具有重要意义。通过阻断这些miRNA相关炎性信号传导可能为胆管癌的治疗提供策略。

2.6 miRNA参与胆管癌吉西他滨耐药 吉西他滨是一种脱氧胞苷类似物，通过阻断DNA双链延长从而中止细胞周期进程[48]。吉西他滨是胆管癌一线化疗药物之一，但多数患者服药后经常观察到吉西他滨的内在或获得性耐药[49]。有证据[27]表明，吉西他滨耐药机制包括Wnt/β-Catenin、NF-кB、AKT和MAPK等通路。多种miRNA参与调节胆管癌对吉西他滨的敏感性和耐药。Meng等[50]研究发现miR-21通过靶向PTEN抑制吉西他滨的细胞毒性，导致其对AKT / mTOR信号传导的抑制作用减弱。Carotenuto等[51]研究发现，抑制miR-1249表达的胆管癌细胞系在化疗后损害了CD133+细胞的扩增及其富集，降低了癌症干细胞标志物的表达，并增加了吉西他滨的化学敏感性，其主要通过靶向卷曲蛋白8/Wnt信号传导来介导具有化学抗性的CD133+胆管癌细胞的扩增。研究发现，miR-210过表达通过靶向缺氧诱导转录因子-1α(HIF-1α)的负调节剂HIF-3α，降低了胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性，miR-210 /HIF-1α的通过调节HIF-3α，导致肿瘤微环境缺氧，引起胆管癌细胞的细胞周期停滞和吉西他滨耐药[52]。miR-130a-3p在吉西他滨耐药的胆管癌细胞中的表达水平上调，进一步研究发现,在胆管癌细胞中过表达的miR-130a-3p通过抑制过氧化物酶体增殖剂激活受体γ增加吉西他滨的耐药性[53]。上述研究表明，miRNA与胆管癌出现吉西他滨耐药存在相关，通过调节这些miRNA表达可能有助于改善胆管癌吉西他滨耐药，以延长胆管癌患者生存时间。

3 外泌体miRNA与胆管癌

许多研究已经证实了肿瘤来源的外泌体在促进癌细胞增殖、侵袭、血管生成和转移方面的功能[54]。外泌体是存在于体液中的miRNA的有效且稳定的转运载体，有证据[55]表明，与正常人群相比，胆管癌患者外泌体miRNA的表达也发生了改变。Kitdumrongthum等[56]发现与正常胆管细胞的外泌体miRNA相比，胆管癌细胞外泌体中存在498个显著差异的miRNA，其中miR-205-5p显著上调，敲低miR-205-5p表达可抑制胆管癌细胞系中的迁移和侵袭。Xue等[57]通过分析胆管癌患者血液来源的外泌体同样发现四种miRNA(miR-96-5p、miR-151a-5p、miR-191-5p和miR-4732-3p)显著上调。研究[58]发现，胆管癌患者血清外泌体miR-200c-3p显著上调，miR-200c-3p表达水平越高，胆管癌进展速度越快。上述研究表明，在胆管癌中存在部分异常表达的外泌体miRNA。虽然对这部分异常表达的外泌体miRNA的生物学功能和分子作用机制的了解有限，但将来其有望成为新的胆管癌治疗靶点及潜在的诊断和预后标记物。

4 小结与展望

越来越多的研究证明了miRNA参与了胆管癌的发生和发展，miRNA在调控基因表达、影响胆管癌的发生及发展过程中起到重要作用，对于这些miRNA的深入研究不仅可以揭示胆管癌的病理生理分子机制，还可以为诊断及治疗胆管癌提供新思路。表达失调的miRNA在胆管癌外泌体和体液外泌体中完整存在且两者表达具有相关性，使其在未来成为胆管癌诊断标记物成为可能。尽管miRNA成为胆管癌诊断标记物具有良好前景，但到目前为止，众多miRNA参与胆管癌的调控仍缺乏共性及准确性，并且miRNA在胆管癌的作用仍主要存在于体外细胞实验阶段，需要在未来进行体内研究，以期形成基于miRNA的胆管癌的治疗策略。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：陈圣负责课题设计，资料分析，撰写论文；陈国想、何中明参与收集数据，修改论文；程树杰、赵继森负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。