宏基因组学测序技术在肝硬化脓毒症中的应用

贝小歌， 陈金军， 黎倍伶

南方医科大学南方医院 肝病中心， 广州 510515

肝脏结构破坏、系统免疫失调以及内在和外周血流动力学异常导致肝硬化患者比普通人群容易发生感染，进展为脓毒症比例更高[1]。据统计，25%～40%肝硬化住院患者存在细菌感染[2]，若发生脓毒症，肝硬化患者的死亡率将增加4倍[3]。耐药病原体的出现、对疾病的认识不足及诊断延误是导致脓毒症高死亡率的常见原因[4]。精准抗生素治疗依赖于致病病原体的早期识别。近年来，宏基因组学测序技术(metagenomic next generation sequencing，mNGS)作为分子诊断的新技术，已成为检测和鉴别临床样本中微生物的有效方法，在脓毒症的诊疗中广泛应用[5]。本文将总结肝硬化相关脓毒症的发病机制和诊疗的最新进展。

1 肝硬化脓毒症发生机制

1.1 肝硬化免疫缺陷 肝硬化是一种以多方面免疫功能障碍为特征的终末期器质性疾病。持续性免疫系统刺激和进行性免疫缺陷会引起肝硬化相关免疫功能障碍，增加死亡风险[6]。肝硬化相关免疫功能障碍状态在先天性和适应性免疫障碍方面已被广泛描述。Lebossé等[7]首次报道了肝硬化患者在循环系统中表达免疫抑制性HLA-DR的CD8+T淋巴细胞亚群的扩增，该亚群会增加感染的易感性并与疾病不良预后相关。既往研究[8]发现，慢性肝病患者中MERTK+单核细胞数量会增加并将抑制对微生物的先天性免疫应答，中性粒细胞的抑菌活性和杀菌蛋白的释放在酒精性肝硬化患者中受到严重损害[9]。肝硬化患者最常见的感染类型是腹腔感染，包括自发性细菌性腹膜炎和细菌性腹水[10]。有研究[11]指出腹水的中性粒细胞比外周血中性粒细胞的吞噬和氧化爆发率分别下降50%和70%。

1.2 肠道菌群移位 肝脏的解剖位置和血液供应经常使肝脏暴露于肠道来源的细菌及其产物。肝硬化出现感染与肠道稳态的变化有关，包括肠道通透性增加、运动减少、菌群紊乱和小肠细菌过度生长[12]。健康人群中，肠腔中的微生物与黏膜相互作用，形成黏液[13]，不仅吸收营养物质，还阻隔病原微生物、毒素等有害物质的入侵。在肝硬化失代偿期，门静脉高压会导致肠道水肿，表现为组织缺氧和细胞间上皮间隙扩张[14]。另外，某些炎症因子(例如TNFα)则可以通过下调紧密连接蛋白和抗生素凝集素来降低肠屏障的完整性[15]。所以，肝硬化肠道炎症和门静脉高压都使肠道通透性增加，均为菌群移位的基础。肠道屏障通透性增加会使细菌片段或病原体相关分子模式(例如脂多糖、鞭毛蛋白或肽聚糖)移位至血液中，激活免疫系统。另一方面，晚期肝病患者常出现胃肠动力障碍，小肠输送时间延长与小肠细菌过度生长有明确的相关性[16]。酒精、病毒、药物的使用等各种刺激因素也会加剧肠道菌群紊乱。许多研究[17]已证实，肠道微生物群丰度及组成在肝硬化病情进展过程中发生明显变化。

1.3 肝硬化全身性炎症 肝脏是调节免疫系统动态平衡和防御感染的重要器官，肝脏中30%的细胞成分(包括内皮细胞、淋巴细胞、Kupffer细胞和胆管上皮细胞)负责器官免疫功能。肝硬化的发生导致肝脏免疫系统的动态平衡被打破，其抗感染的功能随之受到影响。肝硬化患者发生感染时，其全身性炎症主要是通过所有先天性和适应性免疫细胞的活化来介导的。内皮细胞是肝损伤早期反应的第一道防御屏障，激活的内皮细胞将上调黏附分子的表达，诱导有关促炎反应的细胞因子、趋化因子、细胞因子的分泌[18]。而Kupffer细胞是肝脏中第一个与肠道细菌接触的免疫细胞，它能激活肝星状细胞，进而募集成纤维细胞并启动肝纤维化[19]。与健康者相比，肝硬化患者的促炎细胞因子显著升高，包括IL-6、IL-8、TNFα等，并且全身性炎症强度与慢加急性肝衰竭的严重程度相关[20]。在代偿性肝硬化中，损伤的肝细胞会释放损伤相关的分子模式，激活免疫系统，诱发全身性炎症，导致肝内肝外的器官损伤或衰竭。

总之，即使没有感染，代偿性肝硬化也处于全身持续炎症状态，失代偿性肝硬化则表现出更高的炎症水平。在失代偿期肝硬化中，门静脉高压的恶化会导致细菌移位，使病原体相关分子模式从肠腔释放入循环系统。肝硬化和慢加急性肝衰竭患者由于持续暴露于损伤相关的分子模式和病原体相关分子模式，最终会导致肝硬化相关免疫功能障碍，即全身性炎症与免疫抑制共存的状态。肝硬化相关免疫功能障碍状态增加了肝硬化患者对感染的敏感性。细菌移位所致的菌血症以及细胞免疫受损与脓毒症发生率增加有关。

2 脓毒症诊疗

2.1 脓毒症的全新定义 脓毒症-3(sepsis 3.0)的定义为宿主对感染反应失调引起的致命性器官功能障碍。诊断标准为感染引起的序贯性器官功能衰竭评价(sequential organ failure assessment, SOFA)评分≥2分，即“脓毒症=感染+SOFA≥2”，并衍生出快速SOFA(quick SOFA，qSOFA)评分作为脓毒症筛查的主要工具[21]。脓毒症-3的定义强调了非稳态宿主对感染的反应以及对紧急识别的需求，系统的评分标准也便于临床医生对脓毒症尽早地诊断和治疗。

2.2 早期识别和治疗脓毒症的重要性 目前尚无经许可用于脓毒症的药理学治疗方法，但早期使用有效的抗生素可以降低死亡率[22-23]。研究发现，抗生素治疗延迟12 h的患者院内死亡率为28%，而在1 h内接受抗生素治疗的院内死亡率减少为23%[24]，脓毒症患者每延迟1 h使用抗菌药物，将增加8%感染性休克的风险[25]。因此，“存活脓毒症”运动指南建议在1 h内进行抗生素治疗，而且要在抗生素治疗前进行血液培养[26]。

最近多个全球性前瞻性研究[27-28]发现，肝硬化血流感染中耐多药菌达三分之一。 耐药病原体会严重影响到抗生素的治疗效果。不恰当的抗生素治疗已证实与脓毒症死亡率增加有关[29]。不合适的抗生素使用将导致脓毒症患者生存率降低5倍[30]。但也有学者[31]质疑目前抗生素的滥用，并提出应该基于病原体的检测，进行精准的抗生素治疗。因此，需要改进脓毒症的诊断手段，从而指导抗生素的使用。

2.3 传统诊断技术的局限性 体液样本的培养技术目前仍然是诊断感染和脓毒症的金标准[32]。然而，培养技术有许多缺点，例如培养周期时间长 (微生物需要6 h～5 d才能培养至可检测水平，测试抗生素敏感性需要额外24～48 h)、低灵敏度、大样本量、频繁重复检测、抗生素治疗后的假阴性结果风险(30%～63%)增高等[33]。基于培养结果的诊断过程是非常缓慢的，往往需要实验室检查来辅助诊断脓毒症。目前研究较多的生物学标志物一般与炎症机制有关，它们还能用于评估疗效和预后。通常包括CRP、降钙素原、前胰蛋白酶、IL-6、脂多糖结合蛋白、中性粒细胞CD64等[33]。在SOFA评分的基础上增加CRP、WBC等生物学标志物的检测可以提高评估预后的价值[34]。但是，生物学标志物在非感染性疾病中也会异常升高，无法区分感染源性和非感染源性炎症，也就不能可靠地鉴别感染的存在和判断疾病的严重程度。因此，上述标志物未能在临床上广泛使用。

2.4 mNGS应用于脓毒症诊断 有效的诊断学方法应能快速而广泛地检测病原体，同时能检测病原体的耐药性。Palacios等[35]及Xu等[36]分别于2008年、2011年首次运用mNGS在临床病例中检测出新型沙粒病毒、新型布尼亚病毒，开启了mNGS技术在感染中的应用。mNGS的出现克服了培养技术的局限性，广泛应用于遗传病、肿瘤、感染性疾病。基因组学主要分析体细胞中的遗传物质，可以通过整个个体基因组的外显子编码区或常见的单核酸多态性来进行测量[37]。其中，运用PCR分析16S rRNA的方法已被用于细菌感染物种/属水平的鉴定。

与培养技术相比，mNGS的优势显而易见。Rozo等[38]观察了200例脓毒症患者，结合培养、血清学、PCR、mNGS诊断方法，46.5%患者找到了致病原因，证明了基于mNGS的检测可以对一些培养阴性、缺乏配对血清学分析的恢复期血清标本，或其他传统方法无法诊断的患者进行诊断。Grumaz等[39]更是发现mNGS的阳性率比血培养高6倍以上，96%的mNGS诊断结果为可信的，53%的mNGS诊断结果将改变抗生素治疗方案。Grumaz等[40]还证实基于cfDNA的mNGS完整工作流程在大约30 h内完成，可以在较短时间内作出有效治疗干预。因此，mNGS可能为优化肝硬化脓毒症诊断和治疗的有效手段。

早期识别和治疗对于减少并发症和降低死亡率至关重要。基于组学的方法有助于脓毒症的快速病因诊断，在样本收集后仅几个小时就能做出临床决策。也许在未来可以将脓毒症管理限制在有效的治疗时间窗内。然而，受限于昂贵成本、报销制度未完善、测序结果判读的复杂性、样本污染和定植菌等影响因素[41]，目前mNGS还不能替代传统的微生物检测方法。该技术如果能突破成本、技术平台、敏感度等局限性，未来有望成为临床一线检测手段。

3 总结

肝硬化患者免疫功能缺陷，肠道菌群移位严重，感染后容易发生脓毒症。目前脓毒症的诊断主要基于常规的临床实验室指标，其病原体诊断主要依赖于培养，但培养时间长、阳性率低，限制了脓毒症患者的早期诊断和治疗。mNGS可提高病原体的检出，可能为优化脓毒症病原体诊断的有效手段。肝硬化脓毒症未来治疗方向可能从以下几点进行干预：疾病早期，提高对病原体的识别能力；疾病中期，抑制快速发展的炎症反应；疾病晚期，改善免疫功能并消除免疫抑制状态。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：贝小歌负责拟定写作思路，撰写论文；陈金军、黎倍伶参与修改论文，指导撰写文章并最后定稿。