土壤熏蒸对土壤氮循环及其功能微生物的影响研究进展

王 晴, 张大琪, 方文生, 李 园,2, 王秋霞,2, 颜冬冬*,,2, 曹坳程*,,2

(1. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193；2. 现代农业产业技术体系北京市创新团队，北京 100193)

0 引言

目前，高度集约化和长期单一化的连作栽培模式在增加高附加值作物产量的同时也引发了一系列的问题，不仅易导致土壤退化，而且土传病害的发生还愈加严重，使得农作物产量大大降低[1]。目前，国内外主要利用传统耕作调控、生物防治技术、物理消毒技术和化学防治技术等系列措施改善土壤环境，控制土传病害的传播蔓延。其中，在农作物种植前使用熏蒸剂对土壤进行消毒处理，是当前最为有效的防治土传病害的措施[2]。溴甲烷 (methyl bromide) 曾是一种有效的土壤熏蒸剂，但由于其可显著破坏臭氧层，中国已于2015 年禁止其在农业领域中使用[3]。目前，溴甲烷的化学替代剂主要有氯化苦 (chloropicrin)[4]、威百亩 (metam-sodium)[5]、棉隆 (dazomet)[6]、二甲基二硫 (dimethyl disulfide)[7]、1,3-二氯丙烯 (1,3-dichloropropene)[8-10]、异硫氰酸甲酯 (methyl isothiocyanato)[11-12]和异硫氰酸烯丙酯 (allyl isothiocyanate)[13-14]等。

氮素是植物生长必需的营养元素之一。其主要通过氮输入与氮输出等外循环过程以及土壤氮矿化、生物固持、硝化与反硝化作用等内循环过程进行迁移转化，是陆地生态系统循环的基本物质之一[15]。其中，土壤氮素的输入来源主要是氮肥的添加和植物凋落物的分解释放；氮素输出主要包括植物吸收、微生物固定和挥发淋失等过程[16]。大气中的氮气是最大的可自由获取的氮库，但仅有少量的固氮细菌或者真菌可以通过生物固氮作用直接将其利用[17]。土壤氮库中的氮主要以有机氮的形式存在，而植物吸收的氮几乎都是无机形式，因此，土壤氮库中的有机氮必须不断地通过微生物的矿化作用转化为植物可吸收的有效态氮[18]。另外，硝化作用产生的硝态氮容易淋溶到水体和土壤中，反硝化作用的产物N2O 是重要的温室气体，对臭氧层具有破坏作用。因此，土壤氮素内循环不仅影响着土壤对植物本身的供氮能力，还与氮素在大气、土壤、水体中的转化和迁移等过程紧密相关[19]。

鉴于溴甲烷是因为严重破坏臭氧层而被禁止在农业上使用的，对于熏蒸剂的研究，除了关注土壤熏蒸剂本身的药效外，越来越多的学者关注其在环境中的行为。氮既是植物必需的营养元素，又是造成环境污染的重要元素[20]。土壤熏蒸除了能够有效杀灭土壤中有害生物外，对土壤中的非靶标生物也会产生一定的影响，进而改变土壤生态系统的结构和功能[21]。微生物是驱动土壤元素循环转化的引擎，与氮循环有关的关键过程均由微生物所驱动[22-23]，并且微生物发挥作用的过程均是由各种关键酶介导的酶促反应，其酶均由相应的功能基因编码，因此土壤中氮素的转化可以用功能基因和微生物的变化进行表征 (图1)。土壤氮循环过程及主要微生物可以作为生态系统服务功能指标，部分微生物可以作为土壤微生态指示性微生物开展研究。土壤熏蒸对土壤中氮循环转化过程及其功能微生物的影响一直是广大学者研究的热点问题。目前常采用高通量测序、荧光定量qPCR、宏转录组学等分子生物学手段以及常规生物学手段对其进行相关研究[24-26]。本文就近年来关于熏蒸剂对土壤氮循环过程中的固氮作用、矿化作用、硝化作用、反硝化作用及其功能微生物的影响的相关研究进展进行综述，旨在为研究土壤熏蒸的环境风险提供依据。

1 土壤熏蒸对固氮作用及其功能微生物的影响

生物固氮作用是指在固氮微生物的参与下，气态氮还原为氨的过程[17]。根据固氮微生物的特性及其与植物的关系，可以将固氮微生物分为共生固氮微生物 (包括根瘤菌Rhizobium、弗兰克氏放线菌Frankiaceae、念珠藻Nostoc、单岐藻Tolypothrix等)、联合固氮微生物 (包括固氮螺菌Azospirillum、部分假单胞菌Pseudomonas adaceae等) 和自生固氮微生物 (包括固氮菌Azotobactersp.、克雷伯氏菌Klebsiella、部分芽孢杆菌Bacillus、梭菌Clostridium、产甲烷菌Methanogenus及鱼腥藻Anabaena等) 3 类[27-29]。据方文生[24]研究显示，大多数的固氮微生物在土壤熏蒸后都被短暂抑制，比如：用1,3-二氯丙烯熏蒸，显著降低了固氮螺菌属的丰度，而提高了根瘤菌属的丰度；用棉隆熏蒸，前期会降低中慢生根瘤菌属和类芽孢杆菌属的数量；用氯化苦熏蒸，会降低中慢生根瘤菌属和固氮弓菌的数量；二甲基二硫会短暂抑制类芽孢杆菌属的生长，促进固氮弓菌属和中慢生根瘤菌属的生长 (表1)。

固氮酶是生物固氮过程中最重要的酶，其由钼铁蛋白 (由nifD和nifK基因编码) 和铁蛋白 (由nifH基因编码) 两个多亚基组成[30]。只有钼铁蛋白和铁蛋白同时存在时固氮酶才能发生固氮作用。nifH基因可以用来检测固氮微生物[31]。方文生[24]的研究表明，分别使用1,3-二氯丙烯、氯化苦、二甲基二硫和异硫氰酸烯丙酯进行熏蒸的前期均降低了土壤中nifH的丰度，而使用棉隆进行熏蒸的前期，nifH丰度显著高于对照组处理，用1,3-二氯丙烯处理后土壤中的nifH丰度也高于对照组，这可能是由于此前的肥料使用或者农事操作影响了土壤中的营养成分，之前有研究表明，增加土壤中的营养物质可促进微生物的生长[32]，上述熏蒸对土壤氮循环中的固氮微生物影响效应不同可能也是此原因。Li 等[25]的研究表明，威百亩对nifH基因也有短暂的抑制作用 (表2)。

表2 土壤熏蒸对氮循环功能基因的影响Table 2 Effects of soil fumigation on functional genes of nitrogen cycle

2 土壤熏蒸对矿化作用的影响

矿化作用是指在微生物的作用下，将土壤中的有机氮转化为植物可直接利用的无机氮 (硝态氮、铵态氮) 的过程。分为两个阶段：第一阶段为氨基化阶段，在这个阶段各种复杂的含氮化合物如蛋白质、核酸等在微生物酶的水解下，分解形成简单的氨基化合物；第二阶段为氨化阶段，即经氨基化作用产生的氨基酸等简单的氨基化合物，在微生物参与下，进一步转化释放出氨的过程。

颜冬冬等[33]发现，土壤分别用氯化苦、碘甲烷、1,3-二氯丙烯和二甲基二硫熏蒸处理，短期内均能提高土壤中氮的矿化速率，增加土壤中氮素累积矿化量。Neve等[34]的研究表明，用Cyanamid DD95 (1,3-二氯丙烯+1,3-二氯丙烷) 熏蒸土壤后，短期内也提高了氮的矿化速率，但是随着微生物群落的恢复，在熏蒸处理后期，土壤中氮的矿化速率并没有显著差异。陈云峰等[35]报道，用溴甲烷熏蒸后覆盖不透膜 (VIF 膜) ，可提高土壤铵态氮的释放，太阳能消毒也能提高土壤铵态氮的释放。而Collins[36]研究发现，生物熏蒸可提高土壤的矿化速率，但经过威百亩和1,3-二氯丙烯进行化学熏蒸后土壤的氮矿化速率降低。

土壤中的可溶性有机氮 (soluble organic nitrogen,SON) 能反映出土壤有机氮矿化的难易程度，可以作为反映土壤氮素矿化能力的指标。马涛涛等[37]的研究显示，氯化苦处理后土壤中硝态氮含量的变化与SON 含量有着极显著的相关关系。土壤经熏蒸后SON 含量会大幅上升，进而增强了有机氮矿化为无机氮的过程，有助于植物对氮素的吸收利用。有关熏蒸后土壤中SON 转化为矿质氮的具体机制还有待进一步研究[38]，但已有研究表明，熏蒸后土壤中的矿质氮含量增加，主要是由于土壤中的异养微生物将熏蒸剂杀死的微生物残体分解所致[34,39]。

3 土壤熏蒸对硝化作用及其功能微生物的影响

典型的硝化作用是指在有氧条件以及硝化微生物的参与下，将NH3或NH4+经羟胺、亚硝酸盐氧化成硝酸盐的过程 (NH3/NH4+→NH2OH→NO2−→NO3−)，包括氨氧化和亚硝酸盐氧化两个反应。

研究表明，多种熏蒸剂对硝化作用都有着不同程度的抑制作用。程新胜等[40]发现，用溴甲烷和威百亩熏蒸后，土壤的硝化作用受到明显抑制。马涛涛[38]发现，棉隆有较强地抑制氨氧化过程的作用，在一定程度上起到了硝化抑制剂作用。颜冬冬等[33]的研究表明，在分别使用氯化苦、碘甲烷、1,3-二氯丙烯和二甲基二硫4 种熏蒸剂处理后，土壤硝化作用过程受到显著抑制，各熏蒸处理土壤中铵态氮的含量均高于对照组，其中碘甲烷处理组铵态氮的含量最高。Stromberger[41]认为，用溴甲烷熏蒸土壤后，土壤的硝化速率与对照组相比减少55%以上。但是，Chen 等[42]研究发现，使用臭氧熏蒸5 年后，小麦根际土壤中的硝化酶活性增加了10%～34%。由于熏蒸剂本身性质的存在差异，导致不同熏蒸剂的半衰期不同，对硝化作用的抑制持续时间也不尽相同。马涛涛等[38]的研究表明，氯化苦和1,3-二氯丙烯对土壤氮素硝化作用的抑制较强，至少维持28 d，而二甲基二硫和威百亩的抑制作用维持至少14 d；Ibekwe[43]报道，用Cyanamid DD95 熏蒸土壤后至少21 d 内，土壤的硝化作用都会受到抑制。另外，Yan 等[44]研究发现，氯化苦在不同类型土壤中，硝化作用的恢复时间有显著差异。

硝化作用第一步是在氨氧化细菌 (ammoniaoxidizing bacteria, AOB) 和氨氧化古菌 (ammoniaoxidizing archaea, AOA) 作用下完成氨的氧化，第二步是在亚硝酸盐氧化细菌 (nitrite-oxidizing bacteria, NOB) 作用下完成亚硝酸的氧化。其中，氨氧化反应是整个硝化反应的限速步骤，各药剂对硝化作用的抑制主要是抑制AOB 的活性。AOB 产生的氨单加氧酶 (AMO) 可催化NH3或NH4+转化成羟胺，氯化苦、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫和威百亩均能作为AMO 的底物被催化氧化[45]，这些熏蒸剂对AMO 活性抑制效应的强弱主要取决于它们同AMO 的亲和力。Li 等[25]发现，用氯化苦熏蒸后，土壤中AOA 的丰度明显降低，而AOB 的丰度明显增加，这可能是由于氯化苦对AOA 和AOB 的敏感性存在差异，导致主导氨氧化过程的群体发生改变。

氨氧化细菌可分成5 个菌属：亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属 (Nitrosospira)、亚硝化球菌属 (Nitrosococcus)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio) 以及亚硝化叶菌属 (Nitrosolobus)[46]。大多数氨氧化细菌属于β-变形菌和γ-变形菌两类[47]。方文生[24]研究表明，分别用1,3-二氯丙烯和氯化苦熏蒸，可显著减少土壤中亚硝化单胞菌属的丰度，而用棉隆熏蒸的前期会增加亚硝螺菌属的丰度。用1,3-二氯丙烯、氯化苦和二甲基二硫熏蒸，短期内均可降低硝化螺菌属的丰度；而Neilson[48]研究结果表明，使用氯化苦熏蒸后土壤中硝化螺菌属的数量得以提高。

氨氧化反应是指NH3或NH4+在氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO，amoA基因编码)的催化作用下转变为羟胺[47,49]，然后羟胺在羟胺还原酶 (hydroxylamine oxidoreductase，HAO，hao基因编码) 的作用下转变为NO2−[49]。亚硝酸盐氧化反应是指在亚硝酸盐氧化还原酶 (n i t r i t e oxidoreductase，NXR，nxrB基因编码) 作用下[50]，由NO2−转化为NO3−的过程，并且分别用功能基因古菌amoA(AOAamoA)、细菌amoA(AOBamoA)和nxrB的丰度来评估古菌和细菌氨单加氧酶及亚硝酸盐氧化酶的活性。但是目前氨氧化过程的主导群体尚未确定。Leininger 等[51]的研究表明，古菌主导土壤中的氨氧化过程，然而Di[52]研究发现，在含氮丰富的草地中的氨氧化过程是由细菌驱动的而不是古菌，因此结果具有不确定性。李君[26]研究表明，被威百亩抑制的土壤，其硝化过程主要反映在AOAamoA基因，AOBamoA的下降并没有达到统计学的显著水平；同时Chen 等[42]也发现，AOAamoA的丰度高于AOBamoA，但是两者的变化均未达到显著性差异。Fang 等[53]发现，在使用棉隆熏蒸后，会显著降低土壤硝化反应中的AOAamoA、AOBamoA和nxrB功能基因的丰度。

4 土壤熏蒸对反硝化作用及其功能微生物的影响

反硝化作用是微生物在无氧或低氧条件下，将硝酸盐 (NO3−) 作为电子受体完成呼吸作用以获得能量的过程，因其会导致大量的氮流失，因此又称为脱氮作用[54]。反硝化过程主要分为4 个步骤：NO3−→NO2−→NO→N2O→N2。燕平梅等[55]研究表明，分别用溴甲烷、威百亩和氯化苦进行熏蒸处理后，土壤反硝化作用在熏蒸前期均受到抑制，到后期则自然恢复。但是颜冬冬[56]、Chen 等[42]却得到了相反的结果，用氯化苦和棉隆熏蒸土壤后，表现出明显的促进土壤反硝化作用过程；Chen等[42]使用臭氧对土壤进行熏蒸处理5 年后，发现小麦根际土壤中生物反硝化酶的活性增加了4%～5%。对反硝化作用有显著促进作用的氯化苦和棉隆均为含氮化合物，可在土壤中经过微生物降解和化学降解为亚硝酸盐、硝酸盐、硝基甲烷和甲酰胺等小分子的含氮化合物，这些化合物都是典型的反硝化作用底物，从而在一定程度上促进了土壤的反硝化作用过程。

土壤中的反硝化微生物种类众多，在真菌、细菌、古细菌中均有发现[57-58]，并且已有多人证明熏蒸处理可对反硝化细菌的数量产生影响。Roux-Michollet 等[59]发现，用蒸气对土壤进行熏蒸处理后，土壤中的反硝化细菌数量减少，反硝化细菌群落结构遭到破坏，酶活性受到持续的抑制。燕平梅等[60]的研究结果显示，溴甲烷熏蒸改变了土壤中的nosZ型反硝化微生物群落组成和反硝化细菌数量，但是不同浓度的氯化苦、威百亩熏蒸对土壤nirS型反硝化细菌群落多样性指数和均匀度指数无显著影响。方文生[24]研究表明，用1,3-二氯丙烯熏蒸，显著减少了土壤中的假单胞菌和副球菌等的丰度，增加了食碱菌、芽孢杆菌和链霉菌等的丰度；棉隆可抑制芽孢杆菌、假单胞菌、贪铜菌和鞘脂单胞菌的数量，短暂增加无氧芽孢杆菌、黄杆菌及链霉菌的数量；氯化苦在熏蒸初期，可降低黄杆菌、假单胞菌和贪铜菌的数量，在熏蒸后期则可显著刺激芽单胞菌、芽孢杆菌和剑菌的生长；在熏蒸后期，二甲基二硫可显著增加假单胞菌、无色杆菌和链霉菌等的丰度；同样地，异硫氰酸烯丙酯可显著增加黄杆菌、无色杆菌、链霉菌和无氧芽孢杆菌等的丰度。

由NO3−还原成NO2−的过程是在硝酸盐还原酶的催化下完成的。硝酸盐还原酶包含膜结合硝酸盐还原酶 (membrane-bound nitrate reductase,NAR，由narG、narH、narJ基因编码)、周质硝酸盐还原酶 (periplasmic-bound nitrate reductase,NAP，由napA、napB基因编码) 两种[61]，多数生物含有这两种酶[54]。由NO2−还原成NO 的过程是由亚硝酸盐还原酶 (nitrite reductase, NIR) 催化完成的。亚硝酸还原酶包含cdl-NIR(nirS基因编码)和Cu-NIR(nirK基因编码) 两种，这两种酶普遍存在于细菌和古菌中[62]。NO 还原成N2O 的过程是由一氧化氮还原酶 (nitric oxide reductase,NOR) 催化完成，一氧化氮还原酶包含cNOR(cnorB、norC基因编码)、qNOR(qnorB基因编码)两种[63]，广泛存在于各种环境中。N2O 还原成N2的过程是在一氧化二氮还原酶 (nitrous oxide reductase, NOS) 催化下完成的。一氧化二氮还原酶存在于多种细菌 (变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、绿菌门Chloromycota) 和古菌(泉古菌门Crenarchaeota 和嗜盐菌门Halophilic bacteria) 中[64]，nos基因簇通常包含nosL、nosY、nosF、nosD、nosZ、nosR等6 个基因[24]。

反硝化过程中硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶分别通过测定napA和narG、nirS 和nirK、qnorB和cnorB、nosZ基因拷贝数来定量。李君[26]的研究结果表明，只有使用高剂量威百亩处理，土壤中的nosZ、nirS和narG才会被短暂抑制，并且其在第12 天时就恢复到了对照组的水平。Fang 等[65]发现，土壤分别经氯化苦、棉隆、二甲基二硫、异硫氰酸烯丙酯和1,3-二氯丙烯5 种熏蒸剂处理后，均暂时减少了包含napA、narG、nirS和nirK酶编码基因的反硝化细菌的种群。用棉隆和二甲基二硫熏蒸后，带有cnorB、qnorB和nosZ基因的反硝化细菌相对稳定。Chen 等[42]的研究也显示，使用氯化苦连续熏蒸5 年后，小麦田土壤中的nirS和nirK基因均没有显著性差异。由于土壤中能参与反硝化作用的微生物种类较多，许多具有反硝化用功能的微生物均能参与1,3-二氯丙烯、异硫氰酸甲酯、氯化苦和溴甲烷等熏蒸剂在土壤中的生物降解，而且每部分反应的功能基因所起的作用也存在较大差异，因此土壤熏蒸对反硝化过程中的微生物种群和功能基因的影响也不尽相同。

5 总结与展望

综上所述，熏蒸剂对土壤氮循环各过程及其功能微生物均有着不同程度的影响。氮矿化速率决定了土壤中用于植物生长的氮素的可利用性。熏蒸过后，土壤氮循环中矿化作用增强，使植物对土壤氮素的利用率有所提高。虽然硝化作用消耗了铵态氮，减少了氨的挥发损失，但是，硝化作用产生的硝酸盐极易淋溶，引起土壤性状恶化，地下水富营养化且被严重污染等环境问题。土壤经熏蒸剂处理后，硝化作用受到抑制，减少了硝酸盐的产生，在一定程度上减轻了氮素的淋溶损失。土壤反硝化作用可引起氮的气态损失而污染大气，这关系到环境污染和氮素的经济利用；同时，反硝化作用产生的N2O 是重要的温室气体。土壤熏蒸处理能抑制反硝化过程，减少气态氮的挥发损失。总之，土壤熏蒸不仅对氮循环有着重要影响，还影响着与氮循环相关联的大气、土壤、植物生长等各种环境，在一定程度上缓解了对环境的压力。此外，李君[26]、颜冬冬[18]和Ruzo[66]等的研究表明，氯化苦不仅能够控制病害发生还能提高作物产量，表明氯化苦在熏蒸过程产生了肥料效应，这可能是由于氯化苦造成了铵态氮的积累，提高了植株对氮的吸收。

另外，不同的土壤类型和土壤性质也会在熏蒸过程中对氮循环过程的响应及其恢复的影响造成差异。方文生的研究发现，1,3-二氯丙烯、棉隆和氯化苦对功能基因的抑制作用，在江西酸性红壤中比在北京碱性潮土的更强，且抑制时间较长[24]。熏蒸剂处理对土壤中氮循环各过程的影响主要发生在熏蒸初期，待到熏蒸后期，土壤微生物可以恢复到熏蒸之前的水平，对硝化、反硝化过程的抑制作用也都减弱直至消失。而此恢复和重建过程同样受到土壤类型的影响，如控制硝化作用的微生物大部分属于好氧微生物，所以在通气性好的砂壤土中恢复较快，而在酸性土壤中一般会抑制硝化作用的活性，故在酸性土壤中，控制硝化作用的微生物经熏蒸处理后恢复得相对较慢[44]。此外，方文生的研究还显示，分别用异硫氰酸烯丙酯和二甲基二硫进行熏蒸，在北京碱性潮土中的细菌总丰度在第38 天时恢复到对照水平，而在江西酸性红壤中至培养结束时总细菌的丰度也未能恢复[24]。氮循环功能基因的恢复与土壤中熏蒸剂的残留量及残留时间紧密相关，熏蒸剂在砂性土壤中降解速率更快，残存时间较短，延缓了功能基因及功能微生物的恢复。另外，有多个研究发现，氮循环硝化与反硝化过程的功能微生物种群结构、功能基因与硝化、反硝化反应的强度存在着解偶联性，与响应时间存在时间差[18,55,60,67-69]。这可能也是由于矿化、硝化、反硝化等各个过程受到土壤类型、pH 值、温度和土壤有机质等多方面影响的结果。

现阶段，关于土壤熏蒸对土壤中氮循环及其微生物的影响取得了一定的研究进展。李君[26]和方文生[24]均应用荧光定量qPCR 技术对土壤氮循环相关的功能基因及16S rRNA 进行了定量，明确了土壤氮循环主要功能基因对不同熏蒸剂的响应动态；通过宏转录组分析，研究土壤氮循环的功能基因在转录水平上对不同熏蒸剂的响应；方文生[24]还采用高通量测序技术分析了熏蒸条件下土壤细菌及氮循环微生物群落结构和多样性的变化；此外，方文生还借助15N、18O 双同位素法研究了熏蒸土壤中硝化作用、反硝化作用、硝化细菌的反硝化、硝化与反硝化耦合作用对N2O 排放的贡献，明确了土壤熏蒸对N2O 生成路径的影响。

荧光定量qPCR 技术、宏基因组分析、高通量测序等现代化分子技术以及同位素标记等传统方法的应用，使土壤熏蒸对土壤氮循环相关功能基因和微生物的影响的研究愈加透彻，但是其中的研究大多集中于室内试验，关于田间自然条件下的定量试验较少。近期已有研究利用不同氮素转化过程中氮同位素效应的差异及主要微生物过程中特异同位素值 (site preference, SP) 的差异构建出同位素模型，分析自然丰度的同位素值准确地定量主要微生物过程的贡献份额，进而解决自然条件下区分微生物过程的难题[17,70]。总之，运用稳定同位素技术，联合参与微生物过程功能基因和氮素转化的同位素效应，对未来研究氮素转化过程的微生物驱动机制具有重要的指导意义。

有关熏蒸剂处理对土壤中氮素循环影响的研究，除了文中描述的研究较多的固氮过程、矿化过程、硝化过程及反硝化过程外，还包括厌氧氨氧化作用及亚硝酸盐异化还原等其他氮素循环过程。此外，在硝化过程的研究中，全程硝化过程(complete nitrification) 的发现也不断丰富着人们对硝化作用的认识[46]。随着研究的不断深入，尝试使用基因芯片、宏转录组、代谢组学以及多组学等手段，在对土壤氮素循环过程的研究中，将不断会有新途径、新功能微生物以及功能基因被发现和认知，也由此决定下一步的研究方向。