荧光分子印迹传感器快速检测微生物活性及其毒素分析

赵梁 沈阳市疾病预防控制中心设备科 （辽宁 沈阳 110032）

内容提要：目的：探讨荧光分子印迹传感器快速检测微生物活性及其毒素的效果。方法：采用荧光分子印迹传感器快速检测细菌活性和真菌毒素，分别制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物模板和玉米赤霉烯酮结构类似物2,4-二羟基苯甲酸环十二酯荧光分子印迹聚合物模板，建立荧光分子印迹聚合物传感器，分析其对实际样品中细菌活性和真菌毒素的快速测定结果。结果：大肠杆菌荧光分子印迹聚合物与目标菌结合后，可使其荧光强度降低，与荧光空白印迹聚合物结合后，荧光强度降低则不明显。荧光分子印迹传感器对50μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测浓度与回收率均显著低于超高灵敏度液相色谱检测，差异具有统计学意义（P＜0.05）。荧光分子印迹传感器对100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测浓度与回收率，与超高灵敏度液相色谱检测比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：荧光分子印迹传感器对细菌活性和真菌毒素的快速检测效果良好，准确性可靠，与超高灵敏度液相色谱检测效果基本一致，具有检测准确、回收率、检测快速、操作简单等优点，但低浓度真菌毒素检测准确性有待提升，该检测方法应用价值较高。

荧光细菌印迹传感器为现代化学检验的新技术，近年来该技术迅速发展进步，其在食品、环境等领域中应用逐渐较多，具有检测便捷、快速、准确等优势[1,2]。但是，荧光细菌印迹传感器快速检测细菌活性的研究较少，有必要展开针对性研究。为此，本次研究建立了大肠杆菌和玉米赤霉烯酮的荧光分子印迹聚合物模板，并连接酶标仪，组建传感器，针对性检测了细菌活性和真菌毒素，并参照超高灵敏度液相色谱检测结果，分析了荧光分子印迹传感器快速检测的有效性，现总结报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

试剂：玉米赤霉烯酮、盐酸多巴胺、丹磺酞氯、乙腈（色谱纯）、三羟基甲基氨基甲烷、碳酸氢钠、盐酸、乙酸、硼砂、石油醚、乙酚、乙醇、聚乙二醇8000均为分析纯。大肠杆菌噬菌体f2、T4、M13来源：华中科技大学公共卫生学院环境医学研究所提供。实验所用水均为去离子水。

仪器设备：Gen 5Biotek多功能酶标仪（美国）、Agilent 1200高效液相仪及配套荧光检测器（美国）、Supelclean LC-18固相萃取小柱（美国）、EFAA-DC24-RT氮吹仪和QLSPA氮气发生器（上海安谱实验科技股份有限公司）、电热恒温水槽（DK-8A）、eppendorf，Centrifuge 5810 R高速低温离心机（德国）等[3]。

1.2 方法

1.2.1 细菌活性检测

新鲜培养的大肠杆菌接种于10mL LB培养液，培养后取处于对数生长期的大肠杆菌，接种于含0.7%琼脂LB培养基试管，49°C恒温水浴保温，SM缓冲溶液10倍稀释，取100μL含活菌溶液制作3个平行样，另对同类溶液进行高温灭菌处理，制作荧光空白印迹聚合物模板。以完整活菌（大肠杆菌）为模板，选择荧光功能单体（丹磺酞多巴胺），通过多巴胺氧化自聚合反应，制备荧光分子印迹聚合物模板，将细菌荧光分子印迹聚合物与多功能酶标仪合用，建立荧光分子印迹聚合物传感器，评价其对传感器的线性关系。分析其对实际样品中细菌活性快速测定效果[4]。

1.2.2 真菌毒素检测

普通市售纯牛奶每2mL分为1份，共分出60份，其中20份加入50μg/L，20份加入100μg/L，20份加入200μg/L玉米赤霉烯酮，乙睛涡旋混匀后超声提取，离心收集上清，重复此过程提取一遍残渣，两次上清液混合，固相萃取小柱净化样品。不同浓度样品均分为两份，每份含三种浓度样品各10份，分别进行荧光分子印迹传感器快速检测和超高灵敏度液相色谱检测。

以玉米赤霉烯酮结构类似物2,4-二羟基苯甲酸环十二酯作为伪模板，选择荧光功能单体（多巴胺功能单体），合成分子印迹聚合物，连接酶标仪，组建传感器，评价传感器检测的玉米赤霉烯酮线性关系，据此监测牛奶中ZON进行检测（模板洗脱液为0.2 mmoI/L NaHCO3），收集监测结果，与超高灵敏度液相色谱检测结果进行比较。

1.3 观察指标

统计荧光分子印迹传感器快速检测对细菌活性和真菌毒素的检查结果，分析其检测效果。

1.4 统计学分析

采用SPSS20.0统计学软件分析所有数据，以±s表示计量资料，采用t检验；以（%，n）表示计数资料，采用χ2检验，P＜0.05认为差异显著，有统计学意义。

2.结果

2.1 大肠杆菌活性检测结果分析

大肠杆菌荧光分子印迹聚合物与目标菌结合后，可使其荧光强度降低，与荧光空白印迹聚合物结合后，荧光强度降低则不明显，大肠杆菌传感器荧光分子印迹聚合物对活菌的识别能力远大于死菌，不同荧光分子印迹聚合物对应噬菌体的荧光响应（fMIPs为荧光分子印迹聚合物，fNIPs为荧光空白印迹聚合物，P＜0.05）。

2.2 荧光分子印迹传感器和超高灵敏度液相色谱检测结果比较

荧光分子印迹传感器对50μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测浓度与回收率均显著低于超高灵敏度液相色谱检测，差异具有统计学意义（P＜0.05）。荧光分子印迹传感器对100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测浓度与回收率，与超高灵敏度液相色谱检测比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1.荧光分子印迹传感器和超高灵敏度液相色谱对不同浓度玉米赤霉烯酮浓度检测结果比较(±s)

表1.荧光分子印迹传感器和超高灵敏度液相色谱对不同浓度玉米赤霉烯酮浓度检测结果比较(±s)

分组 检测浓度(μg/L) 回收率(%)玉米赤霉烯酮浓度 50μg/L 100μg/L 200μg/L 50μg/L 100μg/L 200μg/L荧光分子印迹传感器检测 48.03±2.03 101.23±1.98 189.28±2.02 97.02±1.56 101.74±1.42 100.04±0.97超高灵敏度液相色谱检测 53.18±1.98 104.73±2.34 185.02±2.03 104.23±2.47 104.96±2.16 92.03±2.65 t 4.054 0.818 1.258 3.859 0.429 0.674 P 0.023 0.187 0.226 0.038 0.521 0.231

3.讨论

微生物及其毒素检测是医药、卫生及食品、工业生产等多个行业质量检测的重要内容，必须严格控制微生物及其毒素含量，确保产品符合相关行业标准。微生物活性是决定其侵袭力的重要指标，其毒素分泌量又是衡量其毒力、危害性的关键指标，因而必须积极探明微生物活性及其毒素情况，进而为疾病诊断、治疗、分析提供客观依据。目前，常用的细菌鉴别、诊断技术较多，但是检测操作复杂、周期较长，同时缺乏针对微生物活性和毒素的检测方法，因而必须积极寻找更为快速、准确的检测技术[5]。

超高效液相色谱是一种新型的化学物质分析方法，广泛应用于临床检验、药物分析、工业生产等行业中，具有超高速度、超高分离度、超高灵敏度等优势，是一种较为准确的检测技术。微生物及其毒素含有大量的大分子蛋白质，而超高效液相色谱检测法对大分子蛋白质的检测效果较好，可完成定性及定量检测，为临床诊断、治疗、预后评估提供可靠的参考依据。目前，超高效液相色谱的分析速度显著提升，但是其分析体系较为复杂，操作难度较高，检测时间相对较长，需积极优化改进，提升其检测效率，同时也应保证其检测准确性和有效性[6,7]。荧光分子印迹传感器快速检测技术是一类新型化学物质分析方法，其检测效果较好，灵敏度较高，且特异性良好，分析体系不断优化，分析速度加快，在检测准确性和检测效果方面具有较好的优势。荧光分子印迹聚合物可特异性识别并结合模板分子，因而具有良好的参考价值，可作为传感器的识别元件，与多功能酶标仪合用，建立荧光分子印迹传感器，其可完成高通量、灵敏、准确检测[8]。近年来，荧光分子印迹传感器快速检测技术发展尽快，广泛应用于医学及工业生产中，成为大分子蛋白质等有机物的重要检测技术，可对多种有机物质进行定性及定量检测。目前，细菌、真菌相关的荧光分子印迹传感器检测逐渐增多，可通过表位印迹或全微生物印迹进行实际检测，但是文献研究相对较少[9,10]。为此研究对荧光分子印迹传感器检测细菌活性分析发现，大肠杆菌荧光分子印迹聚合物与目标菌结合后，可使其荧光强度降低，与荧光空白印迹聚合物结合后，荧光强度降低则不明显，不同荧光分子印迹聚合物对应噬菌体的荧光响应（fMIPs为荧光分子印迹聚合物，fNIPs为荧光空白印迹聚合物）可知大肠杆菌荧光分子印迹聚合物与目标菌结合后，可降低其荧光强度，与荧光空白印迹聚合物结合后，荧光强度降低则不明显，大肠杆菌荧光分子印迹聚合物具有较高的敏感性，且大肠杆菌传感器荧光分子印迹聚合物对活菌的识别能力远大于死菌，检测细菌活性能力较强。此外，应进一步明确荧光分子印迹传感器快速检测对微生物毒素的检测效果，为此本次研究对玉米赤霉烯酮浓度的真菌毒素检测进行了对比分析，结果发现：玉米赤霉烯酮浓度50μg/L、100μg/L、200μg/L样本：荧光分子印迹传感器检测浓度分别为（48.03±2.03）μg/L、（101.23±1.98）μg/L、（189.28±2.02μg/L，回收率分别为（97.02±1.56）%、（101.74±1.42）%、（100.04±0.97）%；玉米赤霉烯酮浓度50μg/L、100μg/L、200μg/L样本：超高灵敏度液相色谱检测浓度分别为（53.18±1.98）μg/L、（104.73±2.34）μg/L、（185.02±2.03）μg/L；回收率分别为（104.23±2.47）%、（104.96±2.16）%、（92.03±2.65）%，可知荧光分子印迹传感器对100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测浓度与回收率，与超高灵敏度液相色谱检测比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；提示荧光分子印迹传感器对100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测结果、回收率，均与超高灵敏度液相色谱检测差异较小，可知其准确性较为可靠，可有效检出玉米赤霉烯酮，为真菌毒素检测提供了新的途径。但是，需注意荧光分子印迹传感器对50μg/L玉米赤霉烯酮浓度牛奶中玉米赤霉烯酮的检测浓度与回收率均显著低于超高灵敏度液相色谱检测，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示荧光分子印迹传感器快速检测对相对较低浓度的玉米赤霉烯酮检测效果存在一定不足，牛奶中低浓度（50μg/L）的玉米赤霉烯酮，荧光分子印迹传感器快速检测的检出浓度相对较低，存在回收率偏低等问题，应高度警惕，在低浓度微生物毒素检测中，考虑联用其他检测方法，以提升检测准确性。

综上所述，荧光分子印迹传感器对细菌活性和真菌毒素的快速检测效果良好，准确性可靠，与超高灵敏度液相色谱检测效果基本一致，具有检测准确、回收率、检测快速、操作简单等优点，同时其对活菌的识别能力远大于死菌，可有效鉴别细菌活性，但低浓度真菌毒素检测准确性有待提升，该检测方法应用价值较高。