超声波辅助提取猪骨素的工艺研究

2021-12-22冯嫣

中国调味品 2021年12期

冯嫣

(吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033000)

我国骨资源丰厚，但综合利用率低[1]。过剩的猪骨被加工成饲料或低附加值的产品，造成严重的浪费。过剩的猪骨发生腐败变质还会对周围环境造成一定的污染。因此，对猪骨资源的可持续利用的研究显得尤为重要。骨素又称鲜骨提取物，是以可食性动物的骨为生产原料，利用热压、抽提、酶解、热压抽取和分离等技术，得到易被人体吸收利用的蛋白质、脂肪、矿物质等营养成分，经过脱脂和一系列衍生化处理得到的骨源食品[2]。本文旨在处理肉品加工中动物骨骼无法高效利用、开发的产品附加值低的问题，以及解决资源短缺，促进环境保护的目的，从而进一步促进畜骨资源的综合利用。

续表

我国人民食用猪肉比较多，新鲜的骨骼资源非常丰富，但综合利用率有待进一步提高。通常，将肉干燥后将新鲜的肉和骨头除去，然后磨成粉末制成动物饲料，将新鲜的肉骨头切成小块，作为大骨头汤的基础材料，或制成方便面调味汤和提取猪肉蛋白质、多肽等。骨胶原多肽(以下简称骨肽)是从动物骨中提取的活性多肽物质[3]。骨骼再利用属于肉类深加工。

超声波有机械产生和磁、电振动等。超声波是频率大于16 kHz[4]的机械弹性波，不会引起听觉失常。超声波辅助提取法作为一种优良的提取方法，具有操作简单快捷、提取率高和不破坏提取物结构等优点[5]，具有广阔的应用前景。超声波处理猪骨不仅可以提高处理后可溶性蛋白质的提取率、猪骨的溶解度和香气[6]，还可以优化提取速度，提高调味料的提取质量。蚕蛹油的超声辅助提取明显优于纯溶剂提取，大大缩减了提取时间，提取质量也良好[7]。同时，在制备骨素的过程中，使用蛋白酶进行水解使提取物中的游离氨基酸增多[8]，而且可以改善骨的味道。

骨中不仅含有大量蛋白质、脂肪、灰分等人体所必需的常量元素，还富含钙、磷等微量元素，可作为食品创新研发的一个营养源。肉类香精作为辅料，稳定性更强，香味更浓郁，品质更高。因此，国内外有许多人对这方面进行了研究，俞苓等进行了猪骨素萃取，通过检测3项数值，确定了最佳提取条件；张志宇等进行了酶解蛋白的试验，得出了酶解猪骨的最佳流程；王朝旭等比较了不同蛋白酶对猪骨水解效果的差异[9]；冷雪娇等研究了超声波在各种肉制品中的应用，如肉类嫩化、肉制品腌制、肉品杀菌、肉的无损检测、肉类调味汤料等，充分肯定了超声波的作用。超声波除了能够加快木瓜蛋白酶的水解速度，还可以提质和优化反应条件[10-11]，同时增强了提取作用。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

新鲜猪骨：购于吕梁星玛客超市；木瓜蛋白酶、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、氢氧化钠：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设备

ALB-224电子天平沈阳龙腾电子有限公司；3ST759-3恒温水浴锅宏华仪器设备工贸有限公司；101-2AS电子恒温鼓风干燥箱北京市永光明医疗仪器厂；LB-90T手持式折光仪广州市速为电子科技有限公司；QFN-650Y超声波细胞破碎仪上海乔枫实业公司；2500c高速多功能粉碎机永康市铂欧五金制品有限公司。

1.3 工艺流程

原料选择及处理→猪骨解冻→切块或粉碎→称量→加酶→超声波提取→过滤并离心→测定。

1.4 单因素试验设计

以猪骨素提取液中的可溶性固形物和蛋白质含量为测定指标，分别考察超声温度、超声功率、超声时间、加酶量、料液比对酶解超声波提取效果的影响，初步确定因素与水平。

1.5 响应面优化试验设计

选取对试验影响较大的单因素水平为响应变量，根据以下试验设计，确定超声波提取猪骨素的最佳工艺流程[12]。通过进行一系列试验，检测两项指标，确定最佳提取方法。

1.6 考察指标与测定方法

1.6.1 可溶性固形物含量的测定

采用阿贝折光仪通过蒸馏水进行校准，待刻度为0时，将蒸馏水擦干。取1～2滴样液置于棱镜上，迅速合上盖板，使溶液均匀涂布在棱镜表面，将光窗对准光源并同时调节目镜视度圈，直至视场视野清晰，视场中明暗分界线对应读数即该溶液的可溶性固形物含量。记录测定时的温度，若测定温度不是20 ℃，可得出对应的修正值[13]。

1.6.2 蛋白质含量的测定

根据凯氏定氮法[14]进行测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 超声温度对猪骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图1可知，在其他条件一致时，温度对猪骨素提取效果的影响较大。随着超声温度的不断升高，猪骨提取液中可溶性固形物和蛋白质的含量总体呈现先上升后下降的趋势，并且温度对二者的影响趋于一致。当温度低于50 ℃时增长缓慢，而当温度高于50 ℃时，浸出物含量大大增加。随着温度的升高，水解度增加。当温度达到60 ℃时，温度达到最高值并出现了转折，随后出现了缓慢降低的趋势。结果表明，猪骨中可溶性固形物和蛋白质的浸出主要在60 ℃以下进行，适当的温度升高对猪骨素的提取有利，但高于此温度后则会影响酶的活力甚至导致酶变性失活，从而影响猪骨素的提取率，确定最佳温度为60 ℃。

图1 不同超声温度对提取效果的影响Fig.1 Effect of different ultrasonic temperatures on the extraction effect

2.1.2 超声功率对猪骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图2可知，在其他条件相同时，功率对猪骨素提取率的影响不大，总体变化趋势相对来说比较平缓。当超声波功率在150～280 W范围内，提取率呈缓慢上升的趋势。当超声波功率在280 W时，检测数值达到最大值。此时，随着功率的增加，超声波的机械振动和磁振动作用也逐渐增强，酶的活性也逐渐增强并对提取有协同增效的作用，从而促进了猪骨中蛋白质和固形物的浸出。但是当功率超过280 W，提取效率又降低。试验结果表明，当超声波温度在280 W时，两项指标均达到最大值，提取效果更好，为最合适的超声功率。

图2 不同超声功率对提取效果的影响Fig.2 Effect of different ultrasonic power on the extraction effect

2.1.3 超声时间对猪骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图3可知，以其他条件相同为前提，不同的时间设置对提取物提取的影响较大。在1～3 h范围内，猪骨中浸出物随着超声处理时间的不断延长而逐渐地增加，并在3 h达到最大值。这是因为超声波的机械振动和磁振动作用会随着超声时间的增加而逐步增加。但提取时间超过3 h，蛋白的水解程度大于含氮浸出物和可溶性固形物的浸出速度。因此，增加趋势相对缓慢，随着时间的延长出现下降的趋势。从试验数据可以得出，在超声波提取猪骨过程中，对于超声时间的把握也很重要，适宜增加提取时间有利于提高猪骨素的提取率，但超过一定时间反而不利于提取。超声时间为3 h时提取效果最佳。

图3 不同超声时间对提取效果的影响Fig.3 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

2.1.4 加酶量对猪骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

在料液比为100∶120(g/mL)、超声功率为240 W、超声温度为60 ℃、超声时间为3 h的条件下，研究酶对提取率的影响，见图4。

图4 不同加酶量对提取效果的影响Fig.4 Effect of different enzyme additive amount on the extraction effect

由图4可知，在一定范围内添加的酶越多，酶的水解速率越高。当木瓜蛋白酶的添加量在0%～1.3%范围内时，随着酶添加量的增加，猪骨中可溶性固形物和蛋白质的含量也随之增加。在1.3%时达到最大值，超过此范围后，猪骨中可溶性固形物和蛋白质的含量随酶添加量的增加而降低。酶的添加量不能过高也不能过低，这可能是因为酶添加量过低，少量的酶无法与全部的底物结合进行反应，导致水解不完全，从而降低提取率。加大酶添加量，使酶与全部的底物进行结合，可加快水解的进行，提高浸出物的得率。但酶的添加并非越多越好，过量的酶会残留在提取液中，影响提取率。

2.1.5 料液比对猪骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

在木瓜蛋白酶添加量为1%、超声功率为240 W、超声温度为60 ℃、超声时间为3 h时研究料液比对提取结果的影响，结果见图5。

图5 不同料液比对提取效果的影响Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

料液比是指猪骨质量和水的比值,对提取结果有影响[15]。此外，料液比对提取率的影响很大。由图5可知，随着料液比的增加,提取率整体呈现先上升后下降的趋势。物料与液体的比例在100∶80～100∶120(g/mL)之间时提取率呈缓慢增长的趋势。料液比为100∶120(g/mL)时，水解程度最大，提取率最高。料液比在100∶120～100∶160(g/mL)之间，提取率降低。底物浓度过低或者过高都不利于进一步研究。酶的反应速度和水解度随着底物浓度的增加而增加，酶与底物结合时反应速度和水解程度都达到最大值。因此，最佳料液比为100∶120(g/mL)。

2.2 响应面优化试验结果与分析

2.2.1 方差分析

表1 优化响应面试验的因素水平表Table 1 The factors and levels of optimized response surface test

利用 Design-Expert(response surface regression)8.0.6 软件对表2中的试验数据进行回归分析，得到可溶性固形物含量(Y1)、蛋白质含量(Y2)对超声温度(A)、超声功率(B)、超声时间(C)、加酶量(D)的回归方程为：

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

Y1=+25.20+1.00A+0.69B+1.01C+0.57D+0.183AB-0.13AC+0.55AD-0.47BC-0.32BD+0.23CD-3.27A2-2.18B2-2.61C2-2.65D2。

Y2=+22.91+0.84A+1.37B+0.31C+0.42D+0.30AB-0.085AC-0.22AD-0.44BC-0.21BD+0.37CD-3.71A2-2.37B2-3.68C2-3.31D2。

以可溶性固形物和蛋白质含量为响应值的响应面方差分析结果见表3和表4。

表3 响应面方差分析结果(可溶性固形物含量)Table 3 The variance analysis results of response surface (soluble solid content)

表4 响应面方差分析结果(蛋白质含量)Table 4 The variance analysis results of response surface (protein content)

由表3可知，响应面模型的P<0.001，表明响应面的回归方程达到了非常显著的水平，其中失拟项的P值是0.2788>0.05，即模型的失拟项不显著，说明回归模型具有良好的模拟程度。相关系数R2为0.9726，模型的校正决定系数RAdj2为0.9453，说明该模型能解释94.53%响应值的变化，误差小，可用来预测试验结果。响应面的显著性分析结果表明，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2对猪骨中可溶性固形物含量的影响极显著(P<0.01)。在所取的各个因素水平范围内，对猪骨中可溶性固形物提取率的影响排序为：超声时间>超声温度>超声功率>加酶量(C>A>B>D)。

由表4可知，响应面模型的P<0.001，表明响应面的回归方程达到了非常显著的水平，其中失拟项的P值是0.0926>0.05，即模型的失拟项不显著，说明回归模型具有良好的模拟程度。R2为0.9865，模型的校正决定系数RAdj2=0.9729，说明该模型能解释97.29%响应值的变化，测量值与真实值之间的差距小，可用来预测试验结果。响应面的显著性分析结果表明，A、B、D、A2、B2、C2、D2对猪骨中蛋白质含量的影响极显著(P<0.01)；C对猪骨中蛋白质含量的影响显著(P<0.05)。对所取的各个因素水平范围内，对猪骨中蛋白质提取率的影响排序为：超声功率>超声温度>加酶量>超声时间(B>A>D>C)。

2.2.2 响应面分析与优化2.2.2.1 可溶性固形物

为研究相关变量之间的交互作用及最优点，通过Design-Expert软件绘制可溶性固形物含量的响应面曲线图与等高线图进行分析，见图6～图12。

由图6可知，等高线沿超声温度轴线条变化较超声功率密集且等高线图接近圆形，说明超声温度对提取的影响比超声功率稍大。这代表超声温度和超声功率的交互作用较弱，对猪骨素中可溶性固形物含量的提取没有显著影响。由三维图可知，超声温度接近60 ℃、超声功率280 W时提取效果好。

图6 不同超声温度和超声功率交互作用下的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic power

由图7可知，等高线接近圆形，说明超声时间和超声温度的交互作用对猪骨素中可溶性固形物提取率的影响不大。由响应面图可知，温度恒定时，随着超声时间的延长，提取效果总体为先上升后降低的趋势。当温度接近60 ℃、时间为3 h时，提取效果极佳。

图7 不同超声温度和超声时间交互作用下的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic time

由图8可知，等高线接近椭圆形，代表超声温度和加酶量的相互作用对猪骨素中可溶性固形物的提取有显著的影响。由响应面图可知，随着超声温度(A)的增加，提取效果总体为先上升后降低的趋势，且A的P值<0.01，即温度对提取效率的影响极显著。超声温度在60 ℃、酶添加量为1.3%时，提取效率最佳。

图8 不同超声温度和加酶量交互作用下的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and enzyme additive amount

由图9可知，随着超声时间的增加，可溶性固形物的得率呈现出先升高后降低的趋势。等高线接近椭圆形，代表超声功率和超声时间的相互作用对猪骨素中可溶性固形物的提取没有显著的影响。同时，超声时间的等高线轴的线条分布更为紧密，说明超声时间对提取效果的影响比超声功率更大。超声功率接近240 W、超声时间为3 h时，提取效果最高。

图9 不同的超声功率和超声时间交互作用下的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and ultrasonic time

由图10可知，等高线接近椭圆形，代表超声功率和加酶量的相互作用对猪骨素中可溶性固形物的提取没有显著的影响。由响应面图可知，超声功率接近240 W、酶的添加量为1.3%时提取率高。

图10 不同超声功率和加酶量交互作用下的响应面图和等高线图Fig.10 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and enzyme additive amount

由图11可知，等高线接近椭圆形，表明超声时间与酶添加量的交互作用影响不显著，由响应面图可知，酶的添加量为1.3%、超声时间达到3 h时猪骨素的提取效果最佳。

图11 不同超声时间和加酶量交互作用下的响应面图和等高线图Fig.11 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic time and enzyme additive amount

2.2.2.2 蛋白质含量

蛋白质含量的等高线图与响应面图分析见图12～图17。

由图12可知，等高线接近圆形，说明超声温度和超声功率的交互作用对猪骨素中蛋白质含量的影响不明显。由响应面图可知，随着温度(A)的增加，提取率呈先上升后降低的趋势，且A的P<0.01，即温度对提取效率的影响极显著。超声温度接近60 ℃、功率为280 W时猪骨中蛋白质提取率最高。

图12 不同的超声温度和超声功率交互作用下的响应面图和等高线图Fig.12 Response surface and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic power

由图13可知，等高线接近椭圆形，说明超声时间和超声温度的交互作用对猪骨素中蛋白质提取率的影响很小。由响应面图可知，随着超声温度(A)的增加，提取效果总体为先上升后降低的趋势，且A的P值<0.01，即温度对提取效率的影响极显著。超声温度接近60 ℃、超声时间为3 h时提取效果最佳。

图13 不同超声温度和超声时间交互作用下的响应面图和等高线图Fig.13 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic time

由图14可知，等高线接近椭圆形，说明超声温度和加酶量的相互作用对猪骨素中蛋白质提取的影响不显著。由响应面图可知，随着超声温度(A)的增加，提取效果总体为先上升后降低的趋势，且A的P值<0.01，即温度对提取效率的影响极显著。超声温度接近60 ℃、酶的添加量接近1.3%时猪骨中蛋白质的提取效果最好。

图14 不同的超声温度和加酶量交互作用下的响应面图和等高线图Fig.14 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and enzyme additive amount

由图15可知，随着超声功率的升高，提取率逐渐升高到最大而后逐渐下降。等高线接近椭圆形，说明超声功率与超声时间的交互作用影响不显著。由响应面图可知，沿超声功率轴等高线的线条分布比超声时间紧密，说明超声功率对结果的影响比超声时间更为显著。当超声功率接近240 W、超声时间达到3 h时猪骨中蛋白质的提取效果最佳。

图15 不同超声功率和超声时间交互作用下的响应面图和等高线图Fig.15 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and ultrasonic time

由图16可知，随着超声功率的提高，提取率逐渐升高到最大而后逐渐下降。等高线图为椭圆形，表明超声功率与加酶量的交互作用影响不显著。由响应面图可知，当超声功率接近240 W、酶的添加量接近1.3%时猪骨中蛋白质的提取效果最佳。

图16 不同超声功率和加酶量交互作用下的响应面图和等高线图Fig.16 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and enzyme additive amount

由图17可知，等高线接近椭圆形，表明超声时间与加酶量的交互作用影响较小。由响应面图可知，当超声时间达到3 h且酶的添加量为1.3%左右时猪骨中蛋白质的提取效果最佳。

图17 不同超声时间和加酶量交互作用下的响应面图和等高线图Fig.17 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic time and enzyme additive amount

2.3 最佳工艺配方的确定和验证

采用Design Expert软件对试验数据进行进一步的优化处理，得出超声温度62 ℃、超声功率290 W、超声时间3.3 h、加酶量1.3%、料液比100∶138(g/mL)的最佳配方。对其进行验证测试，并且进行3组平行试验，数据结果显示此方法提取率最高。测得猪骨中可溶性固形物含量为25.5 °Bx和蛋白质含量为23.12 g/mL，此测定结果与预测数值非常接近，说明此模型拟合程度较高，有利于猪骨素提取工艺的研究。