微量大鼠血浆中对乙酰氨基酚的LC/M S/M S定量检测方法的建立

张 亮，廖宏俊，丁文杰，王小雪，郁 杰

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

非那西丁的体内代谢产物对乙酰氨基酚，又名泰诺林、必理通、百服宁。对于治疗普通感冒引起的发热以及缓解头疼，关节疼等有良好的效果。作为分析化学的一个分支，生物分析广泛的应用于外源性物质（化学合成或天然提取的候选药物，基因改造的生物分子及它们的代谢产物或转化后再修饰的产物）和生物系统中生物大分子（蛋白质、DNA、大分子药物和代谢产物）等的定量测定。

LC/MS技术是以质谱为检测手段的色谱技术，它既有液相色谱的高分离能力也有质谱的高灵敏度和高专属性。在药物微量杂质、药物降解产物、及其生物转化产物的分析鉴定、药代动力学等研究领域得到广泛的应用。本文采用LC/MS/MS建立了微量大鼠血浆中对乙酰氨基酚的定量检测方法，并进行了方法学的验证。

1 材料和方法

1.1 仪器设备及软件系统仪器：AB SCIEX公司的Triple Quad 6500plus；Shimadzu LC-30AD超高效液相色谱仪和SIL-30ACMP自动进样器；大龙MX-S涡旋混合仪；Eppendorf 5810R低温高速离心机。数据处理系统：Analyst 1.6.3。

1.2 试剂和动物大鼠血浆购于BioreclamationINT，批号RAT353600；Acetaminophen-d4购自于Toronto Research Che micals Inc，批号：A161222；4-Acetamidophenol购自于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：5IXZK；甲醇购于SIGMA（色谱纯）；乙腈购于SIGMA（色谱纯）；还有去离子水，及其它分析纯试剂。

4-Acetamidophenol储备液：室温黄光条件下精密称取4-Acetamidophenol 2.531mg，放入玻璃瓶中，后加入2.531mL DMSO溶解，然后用50%ACN稀释储备液，得到浓度为1000ng/mL，2000ng/mL，10000ng/mL，50000ng/mL，200000ng/mL，400000ng/mL，800000ng/mL，1000000ng/mL的 标 准 曲 线工作液，以及质控样品工作液LLOQ QC，LQC，GMQC，MQC，HQC，浓度分别为（1000ng/mL，3000ng/mL，20000ng/mL，500000ng/mL，750000ng/mL），于-30℃到-10℃条件下储存。

Acetaminophen-d4储备液：室温黄光条件下精密称取Acetaminophen-d4 2.135 mg，放入玻璃瓶中，然后加入2.135mL DMSO溶解即为所需工作液，然后用50%ACN稀释得到1000 ng/mL的内标工作液，并于-30℃到-10℃条件下储存。

1.3 液相色谱与质谱参数

（1）色谱条件：色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm；流动相：流动相B：0.1%FA and 2mM NH4OAc in H2O；流动相A：0.1%FA and 2mM NH4OAc in ACN/H2O（95:5；v:v）；洗液：R3:0.1%FA in ACN/MeOH/IPA/H2O(1:1:1:1，v:v:v:v)；R0，R1：50% MeOH；流 速：0.400 mL/min，柱温：40℃；进样量：15μL。

（2）质谱条件：溶剂挥发温度600℃，电喷雾离子源（ESI）正离子模式，离子源喷射电压为5000V，扫描方式为多反应监测（MRM），分析物4-Acetamidophenol离子对为152.2/110.2，内标Acetamidophenol-d4离子对为156.2/114.2。

1.4 样品前处理在室温条件下融解样品，并逐个涡旋。取10.0μL标曲样品、质控样品或测试样品，对于双空白样品和单空白样品取10.0μL空白基质加入到新96深孔板中。在双空白样品孔中加入30.0μL 50% ACN，对其它孔内，分别加入30.0μL内标工作溶液（1000ng/mL），混合均匀。

向每个样品孔内添加260μL 0.1%的甲酸乙腈溶液，封96孔板，涡旋约10min，然后于4℃，3200×g条件下离心10min。取30.0μL上清至另一新96孔板中，每个样品孔中添加570μL去离子水，涡旋至少5min。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的获得及方法的专属性测定用移液器吸取190μL空白大鼠血浆至离心管中，然后分别加入10.0μL标曲和质控样品工作液，涡旋混匀，即得到浓度为50.0ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，2500ng/mL，10000ng/mL，20000ngmL，40000ng/mL，50000ng/mL标曲和质控样品。

在分析批的开始加入双空白样品和单空白样品，然后加入标准曲线样品，并在分析批的最后再加入一条标准曲线。通过液相质谱得到相关数据，用Analyst软件进行拟合，得到如图1所示的标准曲线图。如图2、图3、图4分别是双空白样品图谱、单空白样品图谱及定量下限样品谱图，从所得图谱的结果可以得出对乙酰氨基酚及内标的峰形良好，对乙酰氨基酚及内标的分析不受基质中内源性物质的干扰。对乙酰氨基酚的出峰时间为0.95min，内标出峰时间为0.93min。

图1 4-Acetamidophenol标准曲线图

图2 4-Acetamidophenol双空白样品图谱

图3 4-Acetamidophenol单空白样品图谱

图4 4-Acetamidophenol定量下限样品谱图

2.2 准确度和精密度 准确度和精密度主要根据LLOQ、LQC、GMQC、MQC、HQC浓度水平的质控样品来进行评估。依据法规要求，各浓度水平QC样品平均值的偏差百分比（DEV%）不得超过±15%（LLOQ不得超过±20%），变异系数（CV%）不得超过15.0%（LLOQ不得超过±20%）。

从表1试验结果来看10μL样品处理量方法下，超过2/3的质控样品满足接受标准，且每个浓度都有超过50%的样品满足接受标准。因此，该方法的分析结果满足法规要求。

表1 分析物4-Acetamidophenol质控样品的DEV%与CV%

2.3 基质效应试验考察了该处理方法下，低浓度和高浓度水平下基质对化合物和内标的影响。基质效应因子（MF），是用每个批次的空白基质提取后加上中间溶液得到的样品中分析物和内标的峰面积，除以相应浓度的纯溶液样品中分析物和内标峰面积，计算得出。内标归一化的MF由分析物的MF除以内标的MF得到。从表2、3、4的结果可以看出，该方法下内标归一化的MF的变异系数均在8.2%以内，满足接受标准（内标归一化变异系数不大于15%）。该方法下化合物及内标没有明显的基质效应影响。

表2 分析物4-Acetamidophenol的基质效应

2.4 回收率从表5和表6的结果可知低浓度和高浓度水平的质控样品中，分析物在每个浓度水平以及所有低高浓度水平的提取回收率的变异系数均在8.0%以下，内标的提取回收率的变异系数均在12.1%以内，满足变异系数在15%以内的要求。因此该处理方法下，化合物和内标的回收率均满足GLP法规下的要求。

表3 内标Acetamidophenol-d4的基质效应

表4 内标Acetamidophenol-d4归一化基质效应

表5 分析物4-Acetamidophenol回收率

2.5 稀释效应另外试验测试了DQC样品在20倍稀释下的稀释效应，10μL的样品处理方法中三个重复样品之间的变异系数为4.0，所有稀释样品的浓度与理论浓度之间的偏差均在±4.8%以内，满足接受标准，因此该方法在稀释效应方面满足GLP法规要求（见表7）。

表7 分析物4-Acetamidophenol 稀释效应

2.6 讨 论生物分析的样品大多来源于各种动物的血浆、血清或全血，也包括粪便其它体液。因此，动物福利是生物分析需要考虑的一个因素。动物福利要求，在动物饲养和给药采集样品期间，要让动物很好的适应所处的环境，并采取一些措施来满足试验动物基本的自然需求。从动物福利角度来考虑，血液采集时严格按照体重的比例来采集，而我们通常的试验中会经常用到大鼠。一般样品分析需要处理30μL的样品，由于大鼠等小型动物采样量有限，为了满足多时间点采样的要求，不得不需要更多的试验动物，来进行交叉采样，这就增加了动物个体之间的差异对PK数据的影响。而如果将30μL的样品处理量降至10μL，一只动物就能满足整个试验设计中各时间点采样的要求，不仅可以减少试验动物的使用量，采血量，减少动物之间的差异对PK数据分析准确性的影响，还可以满足动物福利的法规要求。

从试验结果来看，不管是从待分析物还是内标来看，该方式下内标及待分析物之间的基质效应还是回收率均满足GLP法规的要求。另外，稀释效应也均满足GLP法规要求。因此从整个试验结果的对比发现，微量取样的数据是可靠的，微量取样也可以满足各方面的要求。因此，微量大鼠血浆中定量检测对乙酰氨基酚的LC/MS/MS方法成功构建，也是可行的。