大菱鲆弧菌的分离、鉴定及药敏试验分析

郭欣硕

（辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 沈阳110032）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）被称为“多宝鱼”，由中国黄海水产研究所于20世纪90年代从英国引进。辽宁省葫芦岛市的大菱鲆产业兴起于2001年，大菱鲆引进葫芦岛后，经过近20年的发展，已成为葫芦岛市的支柱产业之一。惠及很多养殖户，但多年来因未引进原种鱼苗，缺乏适当的健康繁殖技术，致使苗种优势遗传性逐渐退化，疾病发生率逐年增加。养殖户在使用药物时，在病因不明的情况下，大量用药，不仅导致病原菌的耐药性，还产生大量的药剂药渣，疾病问题已成为制约大菱鲆产业可持续发展的主要瓶颈，因此开展大菱鲆耐药性的相关研究势在必行。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试药物为我国目前被用于水产的抗菌药物，包括氟苯尼考、恩诺沙星、甲砜霉素、硫酸新霉素、氟甲喹、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲 唑/甲氧苄啶。药敏试剂板由全国水产技术推广总站提供，病鱼来自葫芦岛市兴城市2个定点养殖场，1龄大菱鲆，30尾；细菌DNA提取试剂盒（Magen）。

1.2 病原菌的分离鉴定

对典型病症个体样品进行解剖，在TCBS培养基中接种，28℃培养24h，观察菌落特征，挑出可疑菌落接种于普通营养琼脂平板，28℃±1℃培养18～24h，经多次纯化，观察菌落特征，初步分离出水生动物源弧菌。用细菌核酸提取试剂盒提取病原DNA，扩增16 sRNA基因，经测序后，通过NCBI比对序列查找相似菌株。

1.3 耐药性分析

依据南京菲恩医疗科技有限公司提供的试剂板说明书，进行药敏分析试验，筛选纯化后单个菌落，制成0.5麦氏单位浓度的菌悬液。设置阳性、阴性对照，取200μL菌悬液于无菌生理盐水中，混匀后制备成上样菌悬液，将含有样品菌悬液的药敏分析试剂板放入恒温培养箱中，28±1℃培养24～28h。观察分析版各孔中细菌的生长情况，分析试剂板孔底变浑浊为阳性，孔底澄清为阴性。结果判定参照美国临床实验室标准研究所（CLSI）公布的耐药性标准以及南京菲恩医疗科技有限公司提供的方法判定。

2 结果

2.1 分离鉴定结果

经过分离得到45株弧菌，其中大菱鲆弧菌23株。利用16sRNA基因通用引物进行PCR扩增，结果显示，基因片段约1500bp（图1），将产物序列在NCBI的GenBank上进行Blast分析比对，鉴定得到的菌株与大菱鲆弧菌（Vibrio Scophthalmi）同源性均在98%以上，结合形态初步鉴定为大菱鲆弧菌。

2.2 药敏实验结果

2.2.1 大菱鲆弧菌对药物的敏感性 表1、表2结果表明，8种抗菌药物对大菱鲆弧菌的总体敏感性不同，恩诺沙星MIC范围在0.1～0.78μg/mL，呈高度敏感性，敏感率为100%；硫酸新霉素、盐酸多西环素MIC范围是0.1～12.5μg/mL，敏感率分别为43.5%和87%；氟苯尼考MIC介于0.78～100μg/mL，敏感率为78.3%；磺胺甲 唑/甲氧苄啶MIC在1/0.2～12/10 2μg/mL上，敏感率为91.3%；磺胺间甲氧嘧啶钠的MIC范围是2～32μg/mL，敏感率77.9%；甲砜霉素和氟甲喹MIC均在1.56～200μg/mL，MIC浓度相对较高，耐药率分别为52.2%和87.0%，说明明弧菌对两种类型的药物敏感程度较低。

表1 8种抗菌药对大菱弧菌的敏感性

表2 抗菌药物对大菱鲆弧菌的MIC值区间及敏感率对比结果

将分离得到的23株大菱鲆弧菌按照菌株种类进行统计分析，得到MIC50和MIC90，结果见图2，甲砜霉素和MIC50和MIC90分别为9.089和75.34，氟甲喹的MIC50和MIC90分别为4.922和24.182，另外，甲砜霉素和氟甲喹的MIC50和MIC90均高于的它们的平均值，两者显示出较高的耐药水平。

图2 大菱鲆弧菌对各种抗菌药物的感受性

3 讨 论

本试验对辽宁省葫芦岛市的两家大菱鲆养殖企业进行调查，分离并鉴定出大菱鲆弧菌23株，大菱鲆弧菌在当地大菱鲆体内普遍存在，且随着月份和季节的变化，在水温较高、病害多发的6～8月采集数量较高。春秋两季分离出的弧菌较夏季多，也是大菱鲆肠炎的高发季节，其中弧菌是最主要的病原，大菱鲆弧菌、溶藻弧菌、迟钝爱德华菌、鳗弧菌、鲨鱼弧菌等都可引起大菱鲆腹水病。药物敏感试验表明，大菱鲆弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素药物敏感性较高，甲砜霉素和氟甲喹的敏感性较低的MIC50高于平均水平，两者耐药性最强，在该地区可以将恩诺沙星和盐酸环丙沙星用作治疗和预防弧菌感染的首选药物。而磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲 唑/甲氧苄啶、氟苯尼考、硫酸新霉素有部分敏感的药物，在一定程度上也能抑制住菌株的生长。结果显示，在大多数情况下，其对甲砜霉素和氟甲喹的耐药性都很强，表明当地弧菌株可能已对这些药物产生耐药性。因此，在今后用药过程中应交替使用，避免长期过量使用引起耐药性并造成经济损失。另外，可尝试寻找安全高效的天然药物来代替传统药物等，以实现减量增效、提升养殖水产品质量和安全性。