营养对褐飞虱生长和繁殖信号通路的影响

康 奎, 蔡永进, 张道伟, 龚 俊, 张文庆,*

(1. 遵义师范学院生物与农业科技学院, 贵州省赤水河流域动物资源保护与应用研究重点实验室, 贵州遵义 563002;2. 中山大学生命科学学院, 有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 广州 510275)

昆虫在发育过程中所经历的外界营养状态极大地影响着自身的生长和繁殖，而营养信号则是由体内复杂的信号调节网络进行传递，其中类胰岛素信号通路(insulin-like signaling pathway, IIS)和雷帕霉素靶标(target of rapamycin, TOR)通路是在营养水平上调控生长和繁殖最为经典的两个信号通路，扮演着营养传感器的角色(Koyamaetal., 2013; Smykal and Raikhel, 2015)。TOR是一种丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶，通过氨基酸与营养传感相连，在营养信号转导中起着关键的作用(Howell and Manning, 2011; Loewith and Hall, 2011)。目前已鉴定出两种不同的TOR复合物，TORC1和TORC2，其中只有TORC1是对营养敏感的(Kim and Guan, 2011; Lianetal., 2015)。TOR激酶能使真核生物翻译起始因子的抑制蛋白4E结合蛋白(effector 4E-binding protein, 4EBP)失活，使得4EBP不能和真核细胞翻译起始因子4E结合，进而促进mRNA翻译(Roy and Raikhel, 2012)；另外，TOR激酶能够活化核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, S6K)，促使核糖体蛋白S6磷酸化，进而启动5′多嘧啶结构的mRNA的翻译过程，编码相关核糖体蛋白和翻译调节蛋白，促进mRNA蛋白翻译过程(Hansenetal., 2005; Holzetal., 2005)。

IIS信号通路在昆虫中同样相对保守，其在组织营养感知和协调组织生长中有着十分重要的作用(Hietakangas and Cohen, 2009)。果蝇Drosophila中的研究表明，在营养条件较好的时候，胰岛素分泌细胞产生类胰岛素多肽(insulin-like peptides, ILPs)并分泌至血淋巴(Géminardetal., 2009)，而饥饿状态则影响了IIS通路的活性(Brittonetal., 2002)，降低了果蝇类胰岛素多肽(Drosophilainsulin-like peptide, DILP)基因DILP3和DILP5的转录水平(Ikeyaetal., 2002)，且阻止了ILPs从细胞中分泌出去(Géminardetal., 2009)。ILPs分泌到血淋巴后结合细胞上的胰岛素受体(insulin receptor, InR)，InR通过一系列的磷酸化信号级联激活下游蛋白激酶(protein kinase B, PKB)，随后磷酸化叉头状转录因子(forkhead box O, FoxO)，进而影响昆虫的生长发育等生理活动(Nässel and Vanden Broeck, 2016; 陈晓昂等, 2017)。此外，IIS通路中的主要效应物AKT能够通过抑制结节硬化复合体(tuberous sclerosis complexes, TSC)的负调节因子来激活TOR信号通路(Wullschlegeretal., 2006; Loewith and Hall, 2011)。

除了IIS和TOR信号通路之外，AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)也是高度保守的能量稳态调节剂，在相应营养信号方面具有重要的调控作用。AMPK是一种异源三聚体复合物，由一个催化亚单位(α)和两个调节亚单位(β和γ)组成，果蝇中每个亚单位都由一个基因编码(Laws and Drummond-Barbosa, 2016)。在低能量水平下AMPK被激活，以控制许多细胞过程，包括代谢、蛋白质稳态和细胞周期(Laws and Drummond-Barbosa, 2016)。此外研究表明，AMPK活性随着细胞中AMP或ADP水平的升高(当ATP水平较低时)以及上游激酶的激活而增加，激活的AMPK刺激分解代谢和抑制合成代谢过程，从而保持能量稳态(Hardieetal., 2016)，这对于昆虫的生长和繁殖具有重要意义。

保幼激素(juvenile hormones, JH)和20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)是两种典型的昆虫激素，它们与昆虫的繁殖息息相关(Nijhoutetal., 2014; Royetal., 2018)。JH在昆虫咽侧体部位进行合成，其主要作用是维持昆虫幼虫形态，阻止蜕皮激素所促进的变态进程，同时参与变态、繁殖、行为、滞育、寿命等生命过程的调节(Jindraetal., 2013)。而20E的直接作用则是调控昆虫蜕皮的发生，并且同样是重要的生殖调节剂(Raikheletal., 2005)。这两种激素在不同昆虫的生殖事件中所发挥的作用程度不尽相同，似乎在相对低等的昆虫中以JH的调节为主，而在高级昆虫中则以20E的调节为主(Bellés, 2004; Raikheletal., 2005; Royetal., 2018)。然而，这两种激素的合成均受到了IIS, TOR以及AMPK信号通路的调控。因此，为了探究营养对褐飞虱Nilaparvatalugens体内上述生长和繁殖信号通路的影响，本研究设计了3种不同营养浓度的人工饲料，分别饲喂褐飞虱，进而检测在不同营养条件下各个生长和繁殖信号通路相关基因表达的差异，最终完善营养调控褐飞虱生理的调节网络。

1 材料与方法

1.1 试虫来源

褐飞虱采集于广东省韶关、肇庆、惠州、清远等地，并在实验室混合养殖近4年，饲养褐飞虱用的水稻为非抗性水稻品种黄华占。饲养条件为：温度28±1℃，相对湿度80%～90%，光周期14L∶10D。取水稻上孵化出的3龄第2天若虫用于本实验。

1.2 褐飞虱不同浓度人工饲料的配制和饲喂

褐飞虱的全化学人工饲料D-97的配制方法参考Fu等(2001)，配好后用无菌水定容到100 mL，pH保持6.8。以全纯人工饲料D-97作为基本100%人工饲料，在此基础上分别稀释1倍作为50%浓度人工饲料，在50%浓度人工饲料再稀释1倍作为25%浓度人工饲料，保持饲料中其他成分的比例和理化性质不变，一共配制3种人工饲料。

挑选褐飞虱3龄第2天若虫，放置于双通玻璃管(4 cm×2 cm)中。在玻璃管两端覆盖一层Parafilm 膜，吸取40 μL人工饲料于膜上，加盖一层Parafilm膜，使人工饲料夹在两层膜之间，并用解剖针在两端双层Parafilm膜上均匀刺出4个小孔，手指轻轻按压使膜中的人工饲料均匀分散。此外，为了保证褐飞虱取食，用黑色塑料膜包裹双通玻璃管中间部分，露出两端，利用褐飞虱趋光性的特点使其取食人工饲料。以饲喂100%浓度人工饲料的组别为对照组，而以分别饲喂50%和25%浓度人工饲料的组别为处理组。

1.3 褐飞虱生长发育指标统计

按照人工饲料饲喂褐飞虱的方法，每管中放入3龄第2天若虫20头，每个浓度人工饲料饲喂5管，记录每天的存活情况至成虫羽化后第2天，并对5龄第2天若虫和羽化后第2天成虫进行体重称量，统计3龄第2天若虫发育至羽化后第2天成虫的发育历期，并解剖羽化后第6天的雌成虫卵巢统计每卵巢成熟卵量。

1.4 荧光定量PCR检测IIS/TOR和AMPK通路相关基因的表达

在不同浓度人工饲料饲喂至成虫羽化后第2天，后取15头雌成虫，在显微解剖镜下取得卵巢、脂肪体以及其他组织，按照Trizol(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)的说明书，利用Trizol法进行总RNA的抽提。最后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并利用微量核酸蛋白测定仪NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 美国)检测RNA的浓度以及纯度。在检测完RNA的质量后，利用试剂盒Prime Script RT Reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, Kyoto, 日本)进行cDNA第1链的合成。

在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索检测基因的序列，并设计特异性荧光定量PCR引物(表1)，以β-actin基因作内参基因，利用荧光定量PCR检测相关基因的相对表达量。荧光定量PCR反应体系(33 μL): 正反向引物(10 μmol/L)各0.7 μL, KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2×) 16.5 μL，ddH2O 14.1 μL, 1 μL cDNA模板。将上述反应液分装到3个孔中，每孔10 μL，进行3次技术重复。总反应置LightCycler480荧光定量检测仪上进行，程序设置为: 95℃预变性3 min; 95℃变性3 s, 60℃退火20 s, 40个循环。反应结束后根据溶解曲线和扩增曲线确定引物的准确性，最终根据2-ΔΔCT法计算mRNA的相对水平(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.5 AKT, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平检测

随机取不同浓度饲料饲喂至羽化后第6天褐飞虱雌成虫，在显微解剖镜下解剖取得卵巢以及其他组织，按照ProteinExt Mammalian Total Protein Extraction Kit试剂盒(全式金公司，北京)的说明书进行总蛋白的提取。分别配制10% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶，取适量蛋白质溶液(检测AKT时蛋白上样量为80 μg，检测FoxO和AMPK时蛋白上样量为30 μg)进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后将SDS-PAGE胶取出进行转膜，随后将膜浸泡在封闭缓冲液中孵育，用TBST缓冲液清洗3次，根据抗体的效价加入一抗(AKT, AMPK和FoxO磷酸化的效价均为1∶1 000，β-Acitn的效价为1∶4 000)，4℃过夜后再次用TBST缓冲液清洗4次，加入辣根过氧化物酶HRP 标记的二抗(兔抗效价为1∶20 000，鼠抗效价为1∶10 000)，室温孵育50 min后再次用TBST缓冲液清洗3次，最终用ECL显影液进行显色。磷酸化水平的检测使用不同位点的蛋白磷酸化抗体，AKT蛋白磷酸化的抗体位点为S473，AMPK蛋白磷酸化的抗体位点为T172，FoxO蛋白磷酸化的抗体位点为S253。

1.6 活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的测定

为检测蛋白中的ROS水平，取10 μg 1.5节中提取的卵巢、脂肪体和其他组织蛋白，加入CM-H2CFDA探针，至终浓度为10 μmol/L，测定体系终体积100 μL。加入到96孔酶标板中。同时取100 μL带有10 μmol/L探针的PBS，作为阴性对照。37℃避光静置1 h后，在激发光波长485 nm，发射光波长535 nm条件下使用酶标仪测定相对荧光数值，进行数据分析，获得1 μg蛋白中ROS水平。

1.7 20E和JH滴度的测定

分别在不同浓度人工饲料饲喂至4龄第2天若虫、5龄第2天若虫以及羽化后第2天成虫后，取5 mg褐飞虱样品于EP管中，液氮冷冻后在冰上研磨，加入700 μL 75%的甲醇溶液，12 000×g离心10 min，转移上清液至新的EP管，而剩余沉淀则重新加入700 μL 75%的甲醇溶液，按照相同的离心操作重复3次获得上清液，并将4次离心所得上清液进行混合。随后将上清液在浓缩仪浓缩至上清液完全蒸发，加入纯甲醇溶液定容到100 μL，混匀后即制成为20E含量待测样品，最终利用昆虫蜕皮激素酶联免疫试剂盒(雨彤，江苏)检测为20E滴度。

分别在不同浓度人工饲料饲喂至4龄第2天若虫、5龄第2天若虫以及羽化后第2天成虫后，取10 mg褐飞虱样品于EP管中，液氮冷冻后在冰上研磨，加入500 μL正己烷溶液，10 000×g离心10 min，转移上清液至新的EP管，而剩余的沉淀中重新加入500 μL正己烷溶液，按照相同的离心操作重复3次获得上清液，并将4次离心所得上清液进行混合。随后将上清液在浓缩仪浓缩至上清液完全蒸发，加入纯甲醇溶液定容到25 μL，混匀后即制成为JH含量待测样品，最终使用昆虫保幼激素酶联免疫试剂盒(雨彤，江苏)检测JH滴度。

1.8 数据分析

数据为平均数±标准误，采用Duncan氏多重比较法进行多组样本间的差异显著性分析，所有步骤均在软件SPSS 17.0中进行，作图使用Excel 2007。

2 结果

2.1 不同浓度人工饲料对褐飞虱生长发育的影响

用不同浓度人工饲料饲喂褐飞虱3龄第2天若虫发育至羽化后第2天成虫，在期间检测褐飞虱的不同生理指标。结果表明，随着饲喂浓度的降低，褐飞虱在饲喂至5龄第2天若虫开始就出现体重显著下降，一直持续至羽化后第2天成虫(图1: A)，发育到成虫的所需的时间则显著缩短(图1: C)，存活率也是显著降低(图1: B)。对交配过的羽化后第6天雌成虫的卵巢进行解剖，发现随着饲喂浓度降低其卵巢中成熟卵粒的数量随之减少，25%浓度人工饲料饲喂条件下，其卵巢内几乎没有成熟的卵粒(图1: D)。

图1 不同浓度人工饲料对褐飞虱生长发育的影响Fig. 1 Effects of the artificial diet of different concentrations on the growth and development of Nilaparvata lugens5N2D: 5龄第2天若虫Day-2 5th instar nymph; 2D: 羽化后第2天成虫2-day-old adult. 图中数据为平均值±标准误(n=3);柱上不同字母代表差异显著(P<0.05， Duncan氏多重比较法)。Data in the figure represent means±SE (n=3). Different lowercase letters above bars represent significant differences (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

2.2 取食不同浓度人工饲料褐飞虱成虫不同组织中IIS/TOR以及AMPK通路相关基因的表达

用不同浓度人工饲料饲喂褐飞虱至成虫羽化后第2天，通过荧光定量PCR检测不同组织中IIS/TOR通路相关基因的表达量。结果表明，IIS通路的起点胰岛素受体基因InR1在卵巢中的表达量随营养浓度的变化不大，在脂肪体中的表达量在饲喂浓度减半后显著下调(P<0.05)，但在饲喂浓度继续下降至25%后又恢复了表达，而在其他组织中的表达量则随着饲喂浓度的降低而显著降低(P<0.05)，且在饲喂浓度降低至25%后持续下调(图2: A)；InR2的表达则无论是在卵巢、脂肪体还是其他组织中，都随着饲喂浓度的降低而出现下调，其中在其他组织中的表达与InR1的表达情况类似(图2: B)。取食不同浓度人工饲料后，褐飞虱羽化后第2天若虫脂肪体和其他组织中AKT基因的mRNA水平均出现了显著性下调(P<0.05)，而在卵巢组织中，AKT基因的mRNA水平只在25%人工饲料饲喂条件下出现显著下调，说明卵巢当中AKT基因的表达对外界营养条件变化较不敏感(图2: C)；FoxO基因的mRNA水平变化情况同InR1类似，而且在卵巢组织当中，两基因的mRNA水平似乎不受外界营养条件变化的影响，维持了稳定的表达(图2: A, D)。在TOR通路中，TOR,S6K和4EBP在3种组织中的mRNA水平(S6K在25%浓度饲料饲喂时的卵巢中除外)均随着人工饲料饲喂浓度的降低而出现了显著性下调(P<0.05)，其中在其他组织中3个基因的mRNA水平对外界营养浓度变化较为敏感，随着饲喂浓度进一步降低，基因mRNA水平的下调幅度亦进一步加大(图2: E-G)。 最后，饲喂低浓度人工饲料后AMPK亚基基因AMPKα在3种组织中,AMPKβ在其他组织中以及AMPKγ在脂肪体和其他组织中的mRNA水平均出现了显著性下调(P<0.05)，其中AMPKα和AMPKβ的mRNA水平对外界营养浓度变化较为敏感，但是在卵巢组织中，AMPKγ的mRNA水平似乎不受外界营养浓度变化的影响，维持了较为稳定的基因表达(图2: H-J)。

2.3 取食不同浓度人工饲料褐飞虱成虫卵巢和其他组织中Akt, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平

在成虫羽化后第6天，取食不同浓度人工饲料的褐飞虱成虫卵巢和其他组织中Akt, FoxO和AMPK的蛋白磷酸化水平进行检测。Western blotting结果表明：Akt, FoxO和AMPK蛋白的磷酸化水平在卵巢和其他组织随着饲喂浓度的降低均呈现显著上升的趋势(图3)。

图2 取食不同浓度人工饲料羽化后第2天褐飞虱成虫不同组织中IIS/TOR以及AMPK通路相关基因mRNA表达水平Fig. 2 Relative mRNA expression levels of related genes involved in IIS/TOR and AMPK pathways in different tissuesof the 2-day-old adults of Nilaparvata lugens after fed with the artificial diet of different concentrationsA: InR1; B: InR2; C: AKT; D: FoxO; E: TOR; F: S6K; G: 4EBP; H: AMPKα; I: AMPKβ; J: AMPKγ. 以100%浓度人工饲料(全纯人工饲料D-97)作为对照。The artificial diet of 100% concentration (pure artificial diet D-97) was used as the control.

2.4 人工饲料浓度对褐飞虱成虫不同组织中ROS水平的影响

为了进一步验证随着人工饲料浓度的降低胰岛素信号通路相关蛋白磷酸化水平在羽化后第6天褐飞虱成虫各组织上升的原因，本研究检测了卵巢、脂肪体和其他组织中的每微克蛋白中ROS水平。通过检测结果发现，随着人工饲料浓度的降低，各组织中的ROS水平均出现了显著性上升(P<0.05)，并且外界营养浓度越低，组织中ROS水平越高(图4)。

2.5 营养对不同龄期褐飞虱体内20E和JH含量的影响

20E和JH是调控昆虫发育、变态与繁殖最为重要的两种激素，调节昆虫的许多生理进程和性状，例如变态、行为、繁殖、滞育、寿命等。本研究通过检测不同营养条件两种激素的滴度，来探究营养是否调控两种激素的合成来调控自身的生长发育。选择褐飞虱蜕皮后第2天成虫，生理状态相对稳定的条件下，检测两种激素的含量，结果表明：取食不同浓度人工饲料时褐飞虱4龄第2天若虫中JH滴度没有显著差异(P>0.05)，在5龄第2天若虫体内随着饲喂浓度的降低，JH滴度呈现显著下降趋势, 随后在羽化后第2天成虫期显著上升(P<0.05)(图5: A)。而在褐飞虱4龄第2天若虫到羽化后第2天成虫发育阶段之间，随着人工饲料饲喂浓度的降低，20E滴度均呈现显著上升趋势(P<0.05)(图5: B)。

3 讨论

当昆虫进食人工饲料时，大量的营养物质从肠道进入它们的血液或血淋巴，并通过营养感应途径被体内细胞检测到。这些营养感知通路在昆虫中高度保守，能够帮助细胞对细胞内碳水化合物、蛋白质以及脂质等营养物质浓度做出快速的反应。研究表明，果蝇脂肪体中的TOR通路负责检测氨基酸水平，通过未知途径检测其他大量营养物质的水平，而所感知的营养状态再由脂肪体传递到全身(Colombanietal., 2003; Géminardetal., 2009)。因此在果蝇Drosophila和褐飞虱等昆虫中均发现细胞内氨基酸浓度控制着TOR通路靶点的活性(Colombanietal., 2003; Luetal., 2016)。在本研究中，当饲喂营养浓度下降时，显著影响了褐飞虱的生长发育和繁殖(图1)，TOR在褐飞虱羽化后第2天成虫卵巢、脂肪体以及其他组织中的表达水平均显著下调(图2: E)，表明低营养状态抑制了TOR的活性。作为TOR的下游激活靶标，氨基酸可以诱导S6K基因的表达(Luetal., 2016)，而本研究表明S6K在脂肪体和其他组织中的表达量相应地随着营养浓度的降低而下调(图2: F)，这说明营养的不足阻碍了褐飞虱体内mRNA蛋白翻译过程。但值得注意的是，翻译抑制因子基因4EBP的表达在各个组织中也存在显著下调(图2: G)，而在埃及伊蚊Aedesaegypti中，血液喂养使得4EBP过度磷酸化，翻译抑制功能被减弱 (Roy and Raikhel, 2012)。这有可能表明TOR仅促使4EBP的磷酸化而非抑制其转录。

图4 取食不同浓度人工饲料时羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平Fig. 4 ROS levels in different tissues of the 6-day-old adults of Nilaparvata lugens after fed with the artificial diet of different concentrations

在TOR感知营养状态后，脂肪体会相应地分泌几种肽信号调节对营养的系统反应(Géminardetal., 2009; Rajan and Perrimon, 2012; Sanoetal., 2015; Agrawaletal., 2016; Delanoueetal., 2016)。果蝇脑中产生胰岛素的细胞是来自脂肪体的这些肽信号的主要目标。在营养条件良好时，这些细胞产生并分泌3种果蝇类胰岛素多肽(DILP2, DILP3和DILP5)到血淋巴中(Brogioloetal., 2001; Ikeyaetal., 2002)，即胰岛素信号通路被激活；而在营养不良的情况下，这些肽被保留在产生胰岛素的细胞中(Géminardetal., 2009)。在我们的研究中，随着人工饲料中营养浓度的下降，IIS通路中的关键基因InR2在褐飞虱羽化后第2天成虫各个组织中的表达量均显著下调，仅InR1,AKT和FoxO在卵巢中的表达对营养浓度的变化不敏感(图2: A-D)，表明低营养浓度抑制了IIS通路的活性，这和之前的研究结果一致。但尽管AKT和FoxO在脂肪体和其他组织中的转录水平显著下降，它们在卵巢和其他组织中的磷酸化水平是随营养浓度的降低而上升的(图3: A-D)。在棉铃虫Helicoverpaarmigera中的研究显示，AKT的高磷酸化水平激活葡萄糖转运蛋白来感知血液中的低葡萄糖，并增强大脑对其作为能源的吸收(Zhangetal., 2017)，因此AKT和FoxO的磷酸化水平上升一方面是由于IIS信号上升，另一方面可能是回应代谢压力。

图5 取食不同浓度人工饲料时不同龄期褐飞虱体内的保幼激素(A)和蜕皮激素(B)滴度Fig. 5 Titer levels of JH (A) and 20E (B) in Nilaparvata lugens at different developmental stages after fed with the artificial diet of different concentrations4N2D: 4龄第2天若虫Day-2 4th instar nymph; 5N2D: 5龄第2天若虫Day-2 5th instar nymph; 2D: 羽化后第2天成虫2-day-old adult.

不同浓度人工饲料饲喂后，在各种信号通路调节下，最终影响了褐飞虱JH以及20E的合成。在低人工饲料浓度状态下，JH的合成与褐飞虱的发育阶段相关。在4龄第2天若虫阶段，JH滴度与人工饲料浓度的关系不大(图5: A)；在5龄第2天若虫时则随着饲喂浓度的下降而出现JH滴度下调(图5: A)，这可能是为了缩短幼虫到成虫所需的发育时间；而在成虫羽化后第2天，JH滴度在低浓度人工饲料饲喂条件下反而显著上升(图5: A)，这可能是由于成虫阶段需要JH来促进繁殖过程。20E滴度的变化与JH滴度的变化有所差异，无论是在若虫还是成虫阶段20E滴度均显著上调(图5: B)。在幼虫阶段，20E的作用主要是促进蜕皮(Raikheletal., 2005)，这和JH滴度在幼虫阶段下降的结果相吻合，而在成虫阶段，20E同样具有促进昆虫繁殖的作用(Royetal., 2018)。由此可见，在褐飞虱发育到成虫阶段后，低营养浓度会通过提高JH和20E的合成进而维持繁殖功能的正常。

综上可知，褐飞虱在面临营养缺失的情况下，营养信号传导通路IIS, TOR以及APMK通路的关键基因表达均下降，而ROS水平显著上升，通过调节AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平，进而影响JH以及20E的生物合成。