敲低piwi基因对黑腹果蝇血细胞增殖及分化的影响

刘晓楠, 赵素娟, 王 博, 王宏鑫, 郝阳光

(沈阳医学院基础医学院, 沈阳 110034)

果蝇Drosophila的造血发生在两个阶段，首先在胚胎时期的头部中胚层主要由浆细胞及少量晶细胞，这些细胞一部分以游离形式存在于幼虫时期血淋巴中，另一部分以附着血细胞的形式存储在体腔表皮下层的造血袋中(Evansetal., 2003; Hartenstein, 2006; Makhijanietal., 2011)；第2次造血发生在淋巴腺中，淋巴腺是幼虫时期的造血器官，主要由CZ区(cortical zone)的浆细胞、晶细胞，MZ区(medullary zone)的前体血细胞及少量的PSC区(posterior signaling center)细胞构成(Gold and Brückner, 2015; Vlisidou and Wood, 2015)。淋巴腺在果蝇3龄幼虫末期开始裂解并释放成熟的血细胞到血淋巴中(Vlisidou and Wood, 2015)。薄层细胞也属于果蝇成熟血细胞的一种，但只有当果蝇受到感染或损伤时才会产生(Sorrentinoetal., 2002; Krzemienetal., 2010)。

PIWI蛋白是ARGONAUTE/PIWI蛋白家族的一个亚家族，主要参与由小非编码RNA介导的基因调控，尤其可与PIWI相互作用RNA (PIWI-interacting RNAs, piRNAs)以复合体的形式参与在表观遗传学、转录后及翻译水平的基因调控及转座子沉默(Julianoetal., 2011)。PIWI蛋白存在较广泛，在人类、小鼠及果蝇等多种生物中都有发现，果蝇中PIWI蛋白家族包含Piwi, Aubergine (Aub)及Argonaute 3 (Ago3) 3种。PIWI/piRNA介导的DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化等表观遗传学调控对维持生殖细胞正常发育具有重要作用，果蝇PIWI蛋白的缺失可导致雌性或雄性不育(Coxetal., 1998; Schmidtetal., 1999; Kirinoetal., 2009)。母体遗传的Piwi, Aub及Ago3在早期胚胎发生中可维持正常的染色体结构及细胞周期(Manietal., 2014)。此外，研究发现PIWI蛋白在果蝇脑中也有少量表达，蘑菇体αβ神经元中的Aub和Ago3参与长期记忆的形成，PIWI蛋白这种低水平的表达有利于转座子在αβ神经元中的活化，进而产生基因组异质性，可利于个体间大脑功能及行为的变异(Perratetal., 2013)。

我们前期的研究发现piwi基因在果蝇幼虫游离血细胞中表达且Jumu转录因子可调控其转录(Haoetal., 2018)，而Piwi蛋白在造血中的功能研究鲜有报道。本研究以黑腹果蝇Drosophilamelanogaster为实验材料，首先利用免疫荧光染色方法检测Piwi蛋白在果蝇血细胞及造血器官中的表达及定位，并利用RNAi技术在血细胞及淋巴腺组织中特异性敲低piwi基因，检测piwi对果蝇血细胞增殖及分化的影响，为深入理解该基因在造血作用中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 黑腹果蝇品系

野生型黑腹果蝇w1118,e33C-Gal4和Hml-Gal4-UAS-2×EGFP均为东北林业大学金丽华教授惠赠;UAS-piwiRNAi(v101658)购自ViennaDrosophilaRNAi Center(VDRC)。e33C-Gal4在所有血细胞中都表达，在本研究中利用该品系在黑腹果蝇游离血细胞及整个淋巴腺中敲低piwi基因；Hml-Gal4-UAS-2×EGFP在游离、附着血细胞及淋巴腺的CZ区表达，在本研究中利用该品系在黑腹果蝇游离血细胞及附着血细胞中敲低piwi基因(Kulkarnietal., 2011; Makhijanietal., 2011)。所有品系均在标准的玉米酵母培养基中饲养，光周期为12L∶12D，其中w1118品系在25℃培养，本实验所用杂交品系在29℃培养。本实验中杂交品系包括：e33C-Gal4分别与w1118及UAS-piwiRNAi(v101658)杂交，子一代基因型分别为e33C-Gal4/+(对照组)及e33C>piwiRNAi；Hml-Gal4-UAS-2×EGFP分别与w1118及UAS-piwiRNAi(v101658)杂交，子一代基因型分别为Hml>GFP/+(对照组)及Hml>GFP>piwiRNAi。

1.2 Piwi蛋白在黑腹果蝇游离血细胞及淋巴腺中免疫荧光染色定位

为探讨Piwi在造血中的功能，利用Piwi抗体检测Piwi蛋白在果蝇游离血细胞及淋巴腺中的表达及定位。在预冷的PBS中剥离黑腹果蝇w1118、及杂交品系e33C-Gal4/+与e33C>piwiRNAi的3龄中后期幼虫(产卵后约96 h)表皮提取淋巴腺或游离血细胞，将淋巴腺置于EP管中进行固定，游离血细胞需转移至粘附性载玻片并静止30 min，3.7%的甲醛溶液固定15 min，并用PBST(含0.1% Tween-20的PBS溶液)进行冲洗，5%羊血清进行封闭30 min，加入一抗mouse anti-Piwi(1∶100) (受赠于日本东京大学Mikiko C. Siomi教授)，将样品置于冰箱，4℃过夜，加入荧光二抗 Alexa Fluor488或Alexa Fluor 568标记的Goat anti-Mouse IgG(1∶100)(Invitrogen, Molecular Probes)结合2 h，DAPI (1∶500)(Invitrogen, Molecular Probes)结合10 min，用封片剂封片后置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 免疫荧光染色检测黑腹果蝇游离血细胞及淋巴腺血细胞增殖及形态变化

利用PH3 (标记细胞有丝分裂M期)及α-tubulin(标记细胞骨架及有丝分裂时期纺锤体的形成)抗体染色分别检测黑腹果蝇杂交品系e33C-Gal4/+与e33C>piwiRNAi(e33C>piwiRNAi可实现在整个淋巴腺及游离血细胞中敲低piwi基因的表达)的3龄中后期幼虫的游离血细胞和淋巴腺血细胞增殖及形态变化；利用P1(浆细胞的标签蛋白NimC1)及L1(薄层细胞标签蛋白)抗体染色分别检测杂交品系e33C-Gal4/+,e33C>piwiRNAi,Hml>GFP/+及Hml>GFP>piwiRNAi的3龄中后期幼虫淋巴腺和游离血细胞浆细胞及薄层细胞的分化情况，免疫荧光染色方法同1.2节，所用抗体包括： mouse anti-P1及mouse anti-L1抗体(1∶50) (受赠于匈牙利科学院遗传生物学研究中心研究所I. Ando教授)，mouse anti-α-tubulin 抗体(1∶100)(Sigma)；rabbit anti-PH3抗体(1∶200)(Millipore)。

1.4 黑腹果蝇游离血细胞及附着血细胞数量检测

游离血细胞计数：将黑腹果蝇杂交品系e33C-Gal4/+或e33C>piwiRNAi的5头3龄中后期幼虫置于20 μL PBS中，并用镊子将表皮撕开，使游离血细胞溶于PBS并转移至血细胞计数板进行计数，每种品系至少进行10次重复。附着血细胞计数：将黑腹果蝇Hml>GFP/+或Hml>GFP>piwiRNAi的20头3龄中后期幼虫置于-20℃冰箱冷冻10 min，背部朝上放置在载玻片上，并在荧光显微镜下观察并照相，利用ImageJ软件统计每头幼虫背部的血细胞荧光总面积，每种品系采集的幼虫不少于20头，并进行3次重复。

1.5 图像分析及定量

所有用于定量的图像均由莱卡荧光显微镜采集，并用ImageJ软件进行分析。对于游离血细胞中PH3阳性细胞比例，Piwi及P1的蛋白强度的定量，每种品系至少采集10张照片进行统计；游离血细胞中Piwi及P1的蛋白荧光强度为细胞中总荧光信号强度/细胞面积(OD/pixel)。对于淋巴腺中PH3阳性细胞数量是指每片淋巴腺第1叶片上所有PH3阳性细胞的数量，淋巴腺中Piwi信号强度指淋巴腺第1叶片总Piwi荧光强度/淋巴腺第1叶片的面积(mm2)，淋巴腺 P1阳性细胞比例指P1阳性细胞面积占整个淋巴腺面积的百分比，每组采集的淋巴腺不少于20个，所有定量分析均进行3次生物学重复。

1.6 数据分析

采用GraphPad Prism软件进行统计学分析，结果均表示为平均值±标准差，组间差异采用t检验。

2 结果

2.1 Piwi蛋白在黑腹果蝇游离血细胞中的表达及定位

结果显示，Piwi在野生型黑腹果蝇w1118游离血细胞中有较高水平的表达，且主要定位在细胞质中(图1: A-C)。与对照组e33C-Gal4/+(图1: D-F)相比，e33C>piwiRNAi游离血细胞中Piwi蛋白水平明显降低，表明e33C>piwiRNAi成功实现了在血细胞中特异敲低piwi的表达(图1: D-J)。

2.2 敲低piwi基因对黑腹果蝇游离血细胞增殖及分化的影响

血细胞计数结果显示，与对照e33C-Gal4/+(游离血细胞数量1 640±174.1个)相比，e33C>piwiRNAi游离血细胞数量(3 827±256.9个)显著增加(P<0.001)(图2: M)。由于Hml-Gal4-UAS-2×EGFP品系携带GFP蛋白可直接标记血细胞，因此我们利用该Gal4品系检测了piwi基因表达水平降低对果蝇幼虫附着血细胞数量的影响。结果显示，Hml>GFP>piwiRNAi幼虫附着血细胞数量与对照Hml>GFP/+相比未出现显著差异(图2: A, B, N)。

为进一步分析敲低piwi基因对游离血细胞增殖的影响，我们利用PH3抗体检测游离血细胞中处于有丝分裂M期的细胞数量。结果显示，与对照e33C-Gal4/+(0.7459%±0.091%)相比，e33C>piwiRNAi游离血细胞中PH3阳性细胞比例(3.336%±0.565%)显著增加(P<0.001) (图2: C, D, O)。同时，α-tubulin染色结果显示e33C>piwiRNAi游离血细胞在有丝分裂M期时可形成正常的纺锤体且细胞形态与对照相比无显著差异(图2: C, D)。

为分析敲低piwi基因对游离血细胞分化的影响，利用P1及L1抗体分别检测浆细胞及薄层细胞的分化情况，结果显示，Hml>GFP>piwiRNAi游离血细胞中浆细胞的标签蛋白NimC1(P1抗体标记)的表达与对照组Hml>GFP/+相比未出现显著变化(图2: E-H, P)，且敲低piwi基因未引起薄层细胞(L1阳性细胞)的产生(图2: I-L)。

此外，我们还检测了e33C>piwiRNAi游离血细胞的分化情况，与Hml>GFP>piwiRNAi结果一致，未见异常分化(结果未显示)。

图1 Piwi蛋白在黑腹果蝇游离血细胞中的表达及定位Fig. 1 Expression and localization of Piwi protein in circulating hemocytes of Drosophila melanogasterA-I: 分别为野生型w1118(A-C)、对照e33C-Gal4/+基因型(D-F)及e33C>piwi RNAi基因型(G-I)血细胞Piwi信号检测 Piwi expression in the wild type w1118 (A-C), control e33C-Gal4/+ (D-F) and e33C>piwi RNAi (G-I) circulating hemocytes, respectively. e33C-Gal4分别与w1118及UAS-piwi RNAi(v101658)杂交，子一代基因型分别为e33C-Gal4/+及e33C>piwi RNAi；下同。e33C-Gal4 crossed with w1118 and UAS-piwi RNAi (v101658), and the genotypes of the first filial generation were e33C-GAL4/+ and e33C>piwi RNAi, respectively. The same below. A, D, G: Piwi抗体染色Piwi antibody staining; B, E, H: DAPI染色DAPI staining; C, F, I: 分别为前两图的叠加图Merge of the former two pictures, respectively. J: Piwi在游离血细胞中平均荧光强度Mean fluorescence intensity of Piwi in circulating hemocytes. ***P<0.001; ns无显著差异No significant difference (P>0.05)(t检验t-test).

图2 敲低piwi基因对黑腹果蝇游离血细胞增殖及分化的影响Fig. 2 Effect of piwi knock-down on the proliferation and differentiation of circulating hemocytes of Drosophila melanogasterHml-Gal4-UAS-2×EGFP分别与w1118及UAS-piwi RNAi(v101658)杂交，子一代基因型分别为Hml>GFP/+(对照组)及Hml>GFP>piwi RNA。Hml-Gal4-UAS-2×EGFP crossed with w1118 and UAS-piwi RNAi (v101658), and the genotypes of the first filial generation were Hml>GFP/+ (the control group) and Hml>GFP>piwi RNAi, respectively. A-B: GFP标记附着血细胞 GFP-labeled sessile hemocytes; C-D: α-tubulin, PH3与DAPI叠加图Merge of α-tubulin, PH3 and DAPI; E, G: P1抗体(浆细胞的标签蛋白NimC1)染色P1 antibody (plasmatocyte marker protein NimC1) staining; F, H: P1抗体染色与GFP叠加图Overlay of P1 antibody staining and GFP; I, K: L1抗体(薄层细胞标签蛋白)染色L1 antibody (lamellocyte marker protein) staining; J, L: L1抗体染色与GFP叠加图Merge of L1 antibody staining and GFP. M: 血细胞计数Hemocyte count; N: 每幼虫GFP荧光面积GFP fluorescence area/larva; O: 游离血细胞中PH3阳性细胞比例Proportion of PH3+ cells in circulating hemocytes; P: P1平均荧光强度Mean fluorescence intensity of P1. ***P<0.001; ns无显著差异No significant difference (P>0.05) (t检验t-test).

2.3 敲低piwi基因对黑腹果蝇淋巴腺血细胞增殖的影响

淋巴腺是果蝇幼虫时期重要的造血器官，为进一步分析piwi基因在果蝇造血中的作用，我们利用Piwi抗体检测Piwi在黑腹果蝇淋巴腺中表达及定位。结果显示，Piwi在整个淋巴腺都有表达，在各区域的表达水平基本一致，且主要定位在淋巴腺血细胞的细胞质中(图3: A-D)。由于2.2节结果显示敲低piwi基因可引起游离血细胞过度增殖，有丝分裂M期的血细胞数量明显增加，因此利用PH3抗体进一步检测e33C>piwiRNAi淋巴腺血细胞增殖情况。结果显示，与对照e33C-Gal4/+相比，e33C>piwiRNAi淋巴腺中Piwi蛋白的表达显著降低(P<0.001) (图3: E, F, K)，但PH3阳性细胞的比例未显著增加，且淋巴腺也未出现明显增大(图3: G-J, L, M)。

2.4 敲低piwi基因对黑腹果蝇淋巴腺血细胞分化的影响

为分析敲低piwi基因对黑腹果蝇淋巴腺血细胞分化的影响，我们利用P1及L1抗体分别检测浆细胞及薄层细胞的分化情况。结果显示，与对照e33C-Gal4/+(淋巴腺中P1阳性细胞比例32.21%±3.241%)相比，e33C>piwiRNAi淋巴腺中P1阳性细胞比例(51.26%±2.638%)显著增加(P<0.001)(图4: A-C)，即浆细胞过度分化；此外约有20%的e33C>piwiRNAi淋巴腺中出现薄层细胞，而对照中未发现薄层细胞(图4: D-G)。

3 讨论

果蝇的造血谱系与脊椎动物相比相对简单，但果蝇血细胞在免疫防御中的功能及调控血细胞发育的信号通路都与人类血细胞十分相似，一些保守的信号通路如JAK/STAT, JNK, Ras/EGFR及Toll等在果蝇造血中都具有重要的作用，因此果蝇已逐渐成为研究血细胞分化及细胞免疫的良好模型(Bouletetal., 2018)。我们前期研究发现果蝇Forkhead转录因子家族成员Jumu可通过多种方式调控血细胞增殖及分化，而jumu在游离血细胞中的缺失可导致piwi的转录水平降低(Hao and Jin, 2017; Haoetal., 2018)。为研究Piwi蛋白在果蝇造血中的作用，我们首先利用抗体检测确定了Piwi在游离血细胞及淋巴腺中的表达，且发现该蛋白水平在jumu突变体血细胞中明显降低(结果未显示)，该结果进一步证实Jumu对piwi的调控作用。同时鉴于Jumu在果蝇造血中的功能，我们推测piwi基因也可能参与果蝇造血。

图3 敲低piwi基因对黑腹果蝇淋巴腺血细胞增殖的影响Fig. 3 Effect of piwi knock-down on the proliferation of lymph gland hemocytes of Drosophila melanogasterA-F: 分别为野生型w1118(A-D)、对照e33C-Gal4/+基因型(E)及e33C>piwi RNAi基因型(F)淋巴腺Piwi信号检测 Piwi expression in the wild type w1118 (A-D), control e33C-Gal4/+ (E) and e33C>piwi RNAi (F) lymph gland, respectively; C: A与B图的叠加图Merge of Figs. A and B; D: C图红色虚线区域的放大图Magnified view of the red dotted area of Fig. C; G, I: PH3抗体染色PH3 antibody staining; H, J: α-tubulin与PH3叠加图Merge of α-tubulin and PH3; K: Piwi在淋巴腺中的平均荧光强度Mean fluorescence intensity of Piwi in lymph glands; L: 淋巴腺第1叶片中PH3阳性细胞数量Number of PH3+ cells in lymph gland lobe 1; M: 淋巴腺第1叶片的面积Area of lymph gland lobe 1. ***P<0.001; ns无显著差异No significant difference (P>0.05)(t检验t-test).

图4 敲低piwi基因对黑腹果蝇淋巴腺血细胞分化的影响Fig. 4 Effect of piwi knock-down on the differentiation of lymph gland hemocytes of Drosophila melanogasterA-B: P1抗体(浆细胞的标签蛋白NimC1)染色与DAPI叠加图Merge of P1 antibody (plasmatocyte marker protein NimC1) staining and DAPI; C: P1阳性细胞比例Proportion of P1 positive cells; D, F: L1抗体(薄层细胞标签蛋白)染色L1 antibody (lamellocyte marker protein) staining; E, G: L1抗体染色与DAPI 叠加图Merge of L1 antibody staining and DAPI. ***P<0.001; ns无显著差异No significant difference (P>0.05) (t检验t-test).

目前，关于PIWI/piRNA在果蝇的研究中主要集中在生殖细胞发生及早期胚胎发育。与PIWI蛋白结合的piRNAs通过碱基配对与目标mRNA相互作用，PIWI蛋白通过其核酸内切酶活性对靶mRNA进行切割和降解调控， 促进配子的发育 (Rojas-Ríos and Simonelig, 2018)。此外，研究发现Piwi蛋白是早期胚胎发生过程中正常有丝分裂所必需的，piwi基因缺失可引起星状体、纺锤体及中心体形成异常，进而导致细胞不能进行正常有丝分裂且出现异常形态的细胞核(Manietal., 2014)。根据该研究结果，为进一步分析Piwi是否可通过调控有丝分裂来影响血细胞增殖，我们分别检测了piwi基因敲低的游离血细胞及淋巴腺血细胞的增殖情况。结果发现敲低piwi基因导致游离血细胞中处于有丝分裂M期细胞数量明显增加(图2)，加速细胞有丝分裂进程，最终导致游离血细胞过度增殖。尽管Piwi蛋白在整个淋巴腺中都有较高水平的表达，但该基因缺失并未影响淋巴腺血细胞增殖(图3)。此外，我们发现piwi基因敲低果蝇游离血细胞及淋巴腺中细胞核形态及排列均正常，且未出现类似胚胎早期发育时期的有丝分裂缺陷表型，该结果表明Piwi在不同组织器官中调控细胞有丝分裂方式不同。此外，我们前期的研究发现jumu基因的缺失也会导致血细胞的过度增殖及有丝分裂缺陷(Haoetal., 2018)，本研究结果可进一步证明piwi基因是jumu调控血细胞增殖的影响因子之一。

本研究中还发现，piwi在淋巴腺中敲低可导致血细胞的异常分化，包括浆细胞的过度分化及薄层细胞的产生(图4)。我们前期研究表明与piwi基因相似，jumu缺失可引起薄层细胞的产生，因此piwi基因也可能是jumu调控薄层细胞生成的间接作用因子。此外，已有研究表明Piwi通过BMP信号通路参与生殖细胞的不对称分裂(Szakmaryetal., 2005)，研究还发现Piwi通过JAK-STAT信号通路参与急性应激引起的果蝇肠道干细胞增殖(Sousa-Victoretal., 2017)，而BMP与JAK-STAT信号通路均参与果蝇造血作用(Krzemieńetal., 2007; Pennetieretal., 2012)，由此推测Piwi对淋巴腺血细胞分化的调控也可能与这两个信号通路有关。

综上所述，本研究利用Gal4/UAS系统及RNAi技术组织特异性降低piwi基因的表达来研究该基因在果蝇造血中作用，发现piwi可调控游离血细胞增殖及淋巴腺血细胞的分化。下一步，我们将进一步分析piwi在果蝇造血作用中参与的信号通路并验证与jumu基因、BMP及JAK-STAT信号通路的调控关系，为深入研究果蝇血细胞增殖与分化的调控机制提供基础。