非酒精性脂肪性肝病代谢组学研究进展

栾雨婷， 黄钟鸣， 沈文娟， 哈明昊， 顼志兵

上海中医药大学附属第七人民医院 感染性疾病科， 上海 200137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗(IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，包括非酒精性单纯性肝脂肪变(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌(HCC)[1]。随着饮食和活动方式的改变，肥胖在全球范围内盛行，全球患病率约25.24%[2]，并呈上升趋势。在大陆地区，其患病率约29.81%[3]，并已成为我国第一大慢性肝病和健康查体肝酶异常的首要原因[4]。在美国，由NAFLD所产生的NASH也非常普遍，预计到2030年，NAFLD、NASH及其相关HCC病例将分别增长21%、63%和137%[5]。因此，NAFLD是中国乃至世界的卫生问题及经济负担。目前其机制并未完全阐明且无特效药物。针对NAFLD引发的肝纤维化，肝活检是其金标准，但现实难以广泛开展。然而越来越多的证据表明NAFLD是一种与代谢紊乱相关的多系统疾病，与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2MD)、代谢综合征密切相关。因此，近期国际专家小组达成共识，将其更名为代谢相关脂肪性肝病[6-8]。随着测序技术的迅猛发展，以基因组学、代谢组学、转录组学、蛋白质组学为代表的系统生物学技术提供了新的技术与思路。区别于其他组学技术，以内源性小分子代谢物为研究对象的代谢组学可以很好的揭示机体变化的最终代谢结果。因此，本文就代谢组学技术在NAFLD中的研究进展作如下总结。

1 代谢组学概述

1.1 代谢组学含义 代谢组学最初于1999年由Nicholson等[9]首先提出，是揭示机体受到外界刺激或干扰后内源性代谢产物发生变化与规律的学科。根据代谢产物的理化性质可以分为氨基酸类、肽类、碳水化合物类、能量类、脂类、核苷酸类、维生素和辅助因子类及外源化合物。通过高通量测序，对所测样本进行定性定量分析，反应机体的代谢产物、途径和规律。

1.2 代谢组学方法与过程 目前，广泛应用于代谢组学数据采集的技术平台有氢/碳核磁共振技术(1H，13C-NMR)、气相色谱-质谱技术(GC-MS) 、液相色谱-质谱技术(LC-MS)、毛细管电泳-质谱技术(CE-MS)以及直接进样质谱技术(DIMS)等[10]。LC-MS因其选择性好、高通量、灵敏度高的特点已成为代谢组学中最常用的平台[10]。严格样本采集后根据所选择技术平台的不同对样本进行相应的预处理，然后进行代谢物的分离分析、数据处理、生物学功能阐释等。作为快速发展的新学科，代谢组学较为全面的展示了机体的代谢结果，为临床医学提供了新的技术和方法。

2 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD的疾病谱包括NAFL、NASH、肝硬化和HCC。尽管NAFL是一个良性的过程，可以首先通过饮食和运动来改善，但其有发展为NASH和肝硬化并引起T2MD的风险[11]。而在其进展过程中缺乏敏感而特定的临床诊断生物标志及特效药。随着科技的发展，代谢组学为NAFLD研究提供了强大的技术工具。

2.1 代谢组学对NAFLD发病机制研究的推动作用 NAFLD机制尚未完全明确，1998年Day等[12]提出“二次打击”学说。随后Tilg等[13-14]提出“多重平行打击”理论，包括遗传因素、IR、氧化应激、脂毒性、慢性炎症、纤维化、免疫和肠道菌群等，系统复杂涉及肝脏、肠道及脂肪组织内的各类细胞及代谢产物。而高通量及高灵敏度特性的代谢组学展示了疾病状况下的代谢产物及代谢网络，为阐明NAFLD的发病机制带来了新的技术手段。Cabré等[15]采用定量靶向代谢组学对因肥胖症行减肥手术的患者(n=270)和对照组(n=50)进行比较，以期发现肝脏代谢与肥胖之间的关联性。他们发现NASH患者血浆中α-酮戊二酸和乳酸盐浓度升高，表明通过谷氨酰胺分解来补充柠檬酸循环可能也是NASH发作的关键点。类维生素A是维持肝脏代谢稳态的重要内源性化合物，Zhong等[16]对正常人(n=50)肝脏和NAFLD患者(n=22)肝脏中的维生素A进行了定量代谢组分析。与正常肝脏相比，NAFLD患者肝脏中棕榈酸视黄酯、活性类视黄醇全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)、13-顺式维甲酸(13-cisRA)和4-oxo-atRA的浓度显著降低，而视黄醇水平保持不变。atRA浓度与棕榈酸视黄酯和13-cisRA呈正相关。他们在人类组织中首次检测到atRA的活性代谢物4-oxo-atRA，表明这种类维生素A可能有助于人体类维生素A的信号传导。肝脏维生素A的稳态平衡被打破可能导致疾病进展。为了解不同类型的脂肪酸在推动NAFL向NASH早期发展中的作用，研究人员[17]利用了棕榈酸(C16∶0)和棕榈油酸(C16∶1)诱导的脂质过载HepG2细胞模型及稳定同位素标记的脂质组学技术进行试验。结果表明，C16∶0引起炎症和细胞死亡，而C16∶1引起大量脂滴积聚。此外，多球壳菌素对鞘脂合成的抑制，加重了C16∶0诱导的脂质凋亡。在C16∶0和C16∶1诱导的两组细胞模型中脂质谱不同，阐明了特定脂肪酸影响脂质代谢并引起脂质毒性或脂质滴形成。这表明了饱和或单不饱和脂肪酸在肝脂质毒性中起作用，同时多球壳菌素抑制作用通过神经酰胺间接途径加剧了脂质凋亡。

2.2 代谢组学对NAFLD无创诊断的推动作用 目前用于定义NAFLD的临床标准多样(例如肝酶异常、肝脏超声、肝脂肪指标和肝活检等)，但多数检测和方法缺乏敏感性及特异性。超声对轻度脂肪肝诊断的敏感性、特异性有待提高，且弥漫性肝纤维化和早期肝硬化时也可观察到脂肪肝的典型特征[18]。尽管患者进展至纤维化进程较慢，但发生纤维化和肝硬化时，NAFLD患者的病死率为16%[19]。而目前“金标准”肝活检因其有创且有一定并发症，同时存在取样及病理诊断误差等缺陷，未能广泛开展用于疾病的诊断及动态监测。鉴于近期国际专家小组重新定义的NAFLD不再区分患者有无NASH，无创诊断NAFLD的重点需要聚焦肝纤维化、肝脏炎症损伤及肝脂肪变程度，从而减少肝活检的需求[20]。Moolla等[21]对3组受试者(121例NAFLD、48例酒精性肝硬化和106例对照组)进行尿类固醇代谢组分析，发现代谢组学结果可将早期(F0～F2)与晚期(F3～F4)肝纤维化有效分离[受试者工作特征曲线下面积(AUC)=0.92]。此外，对照组分别与NAFLD晚期纤维化(AUC=0.99)和NAFLD肝硬化患者(AUC=1.0)几乎完全分开。同时NAFLD肝硬化患者与酒精性肝硬化患者也可有效区分开(AUC=0.83)。他们认为此方法可作为区分NAFLD纤维化程度及诊断的无创生物标志物，且可以显著减少对肝活检的需求。Mayo等[22]对正常肝脏及NAFL和NASH的受试者血清进行了代谢组学测定，发现了540种脂质和氨基酸，通过逻辑回归分析在467例NAFLD患者的测试组中确定了2个甘油三酸酯组的诊断模型，可分别用于区分正常肝脏和NAFL以及NASH和NAFL。该诊断模型随后在192例(7例正常肝脏、109例NAFL和76例NASH)患者的单独队列中得到了验证。Yang等[23]将受试者分为对照组(n=23)、NAFLD组(n=42)、慢性乙型肝炎(CHB)组(n=17)以及同时患有NAFLD、CHB组(n=22)共4组，进行血清脂质组学分析。大多数中性脂质和神经酰胺在同时患有NAFLD、CHB组中升高，在CHB组中降低。三酰基甘油(triacylglycerol，TAG)在NASH患者中增加。血清单不饱和TAG是NASH的重要预测指标，与组织学活性呈正相关(r=0.501，P<0.001)。其在NAFLD组(AUC=0.831)中显示出对NASH的良好预测性，并在CHB组(AUC=0.833)中得到验证；单不饱和TAG的增加可能是NAFLD和CHB患者NASH的特异性标志物。

2.3 代谢组学对NAFLD药物作用与疗效研究的推动作用 目前针对NAFLD的药物包括调控核转录因子类、降脂类、胰岛素增敏类、平衡代谢类、抗氧化类等[24]。尽管全球发病人数众多，但目前仍无公认的保肝药物用于NASH的常规治疗，这可能与发病机制中信号通路相互交织靶点众多有关。因此，药物作用机制和疗效评估显得十分重要。国内学者[25]采用非靶向脂质组学方法研究参苓白术散(ShenlingBaizhu San，SLBZS)对NAFLD大鼠的保护作用。结果表明SLBZS可有效减轻高脂饮食大鼠NAFLD和异常脂质代谢。其对肝脂质种类的影响主要与甘油磷脂和甘油脂代谢的调节有关。此外，通过Sirtuin 1(SIRT1)选择性抑制剂EX527抑制肝脏中SIRT的表达，发现SLBZS对肝脂质代谢有益作用的潜在机制可能与肝脏中的SIRT1激活有关。在一项槲皮素对NAFLD大鼠作用机制的研究中[26]，研究者通过喂食高脂蔗糖饮食30 d和50 d来建立2组NAFLD大鼠模型。结果表明，在高脂蔗糖饮食30 d模型组中，槲皮素通过调节脂肪酸相关代谢产物(肾上腺酸等)、炎症相关代谢产物(花生四烯酸等)、氧化应激相关代谢产物(2-羟基丁酸)和其他差异代谢物(柠檬酸等)来改善NAFLD。而在50 d模型组中并未改善，表明槲皮素可能通过相关代谢途径改善早期NAFLD，但无法逆转长期高脂饮食引起的炎症反应。这种将代谢组学与实验方法相结合的方式，为研究药物治疗复杂疾病的作用和机制提供了途径。国外研究人员[27]利用胰高血糖素样肽1受体激动剂艾塞那肽(Exe)治疗NASH模型小鼠，发现Exe改善了与IR和脂毒性相关的脂质组学特性，减少了肝脂质副产物(二酰基甘油、神经酰胺)，降低了肝脂肪形成基因(Srebp1C，Cd36)、炎症和纤维化相关基因(Tnfa，Timp1)的表达。此类研究可能对NASH患者中胰高血糖素样肽1受体激动剂的潜在作用机制具有重要的临床意义。一项基于ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸的复合维生素治疗小儿NASH的研究[28]发现，经过饮食和微量营养素疗法治疗后患者临床及生化指标得到改善。值得注意的是，他们首次报道了小儿NASH治疗前后血浆中ω-6/ω-3脂肪酸比例变化，可用于监测患者的预后。

3 小结

尽管代谢组学已广泛运用于NAFLD的研究，且在各个方面均已取得一定的研究进展。但迄今为止，仅一种生物标志物还不能无创鉴别出患有NASH和轻度至中度纤维化的患者。多种脂质及代谢物的改变参与了NAFLD的发生发展，但现有结果仍存在一定程度的差异，可能与研究取样标本的标准化[29]、仪器分析和数据处理、分析技术[30]等有关。同时，组学技术的高通量和高灵敏度对样本的预处理[31]和数据分析方法标准化[32]也提出了更多的要求。

同时，单一的代谢组学只能从代谢角度对NAFLD进行研究，而NAFLD是多种因素共同作用的一类疾病。尽管还未能将NAFLD的不同阶段和NASH的严重程度准确区分开，有研究者们正试图将代谢组学与蛋白组学[33-34]、基因组学[35]等进行多组学结合[36]研究，以期多途径多角度确定发病的确切靶点。在未来的临床试验中，可能需要多指标联合诊断来提高检验效能[37]。加强多组学技术在NAFLD领域的临床试验，不仅能够加深对NAFLD发生机制、疾病归转与预后的理解。同时实现组学技术的临床转化，将NAFLD的无创诊断推广至社区，构建“家庭-社区-医院”分层全程管理模式[38]，从而减少肝活检需求。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：栾雨婷负责撰写修改论文；黄钟鸣、沈文娟、哈明昊负责参与文献的收集、整理；顼志兵负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。