肥胖的转录组学研究以及针灸治疗进展

董明

古美社区卫生服务中心，上海201102

肥胖是根据世界卫生组织的身体质量指数(body mass i ndex，BMI) 而进行分类的，当体质量指数(BMI) ≥30.0 kg/m2时被认为是肥胖[1]。肥胖已成为世界性的流行病[2]，自1980年至2015年，世界上有73 个国家的成人和儿童肥胖率翻了一番，其他大多数国家的肥胖率也在不断上升[3]。目前世界卫生组织的统计报告显示，20 岁以上的成年人中，高达35%超重(BMI≥25 kg/m2)，11%属于肥胖(BMI≥30 kg/m2)，这种现象在许多久坐不动的生活方式日益盛行的高收入国家更为突出[4]。老年人肥胖的患病率也在逐年增高，严重影响老年人的健康和生活质量。肥胖可导致多种疾病，影响人体多个系统与组织，甚至会对肥胖患者本人的预期寿命产生影响。在超重或肥胖（BMI≥25 kg/m2）的人群中，BMI 与死亡率呈正相关，BMI 越高，总死亡率越高[5]。美国研究发现，45 岁以上的超重患者，体质量每增加2 kg，寿命缩短25 d，死亡率增加28%；超重27.2 kg，死亡率增加56%。65～74 岁年龄区间的老年肥胖人群的死亡率是非肥胖人群的2 倍。肥胖与心血管系统疾病、胃食管反流、泌尿系统疾病、消化系统疾病、内分泌代谢疾病和肿瘤等密切相关。肥胖已经成为全球范围内不可忽视的重大公共健康问题。

世界范围内肥胖的患病率急剧上升，与可口的高热量饮食和高糖饮料的不断供应以及习惯久坐并且依赖各种电子产品的现代生活方式密切相关。尽管暴露在致病环境下，仍有相当一部分人群保持正常体质量，这表明在个体水平上存在着与先天因素有关的遗传机制[6]。双胞胎、家庭和收养研究也表明，BMI 与遗传有着直接的关系[7]。不仅如此，孕妇在怀孕期间的饮食会影响DNA 的甲基化模式，这种模式在后代中可以持续很长时间，甚至可以遗传[2]。例如，患有妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）的肥胖患者，母系印迹基因中胚层特异性转录物(mesodermspecific transcript, MEST) 相较于非GDM 母亲显示甲基化水平显著降低(4%～7%)。而MEST 的表观遗传失调可能会导致患有GDM的肥胖母亲所生的婴儿存在终生的肥胖易感性[8]。胎儿暴露在有糖尿病或母亲肥胖的宫内环境中，出生时胎龄大的婴儿患代谢综合征的风险也会增加。这说明母亲的肥胖可导致后代持久的基因位点和特定组织的表观遗传改变[9]。研究发现[10]，与非肥胖父亲的孩子相比，来自肥胖父亲的孩子在印迹胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2, IGF2) 基因的差异甲基化区域(differentially methylated regions, DMRs) 上观察到较低的甲基化水平。这表明通过父亲的先兆暴露也可以导致后代印迹基因DMRs的表观遗传转移。弗雷明汉心脏研究(Framingham Heart Study)还对父亲的肥胖和后代的代谢影响进行研究后发现，父系早发性肥胖个体的血液中的谷丙转氨酶显著高于非父系肥胖个体[11]。这说明肥胖人群不仅可以使后代具有肥胖易感性，还会通过DNA 甲基化等表观遗传修饰影响后代的其他正常基因的表达。

1 转录组学在肥胖发病机制研究中的应用

1.1 转录组测序技术概述 转录组可定义为存在于生物样本中的整套转录本, 由执行无数功能的几类RNA 组成[12]。包括蛋白质编码信使RNA (mRNA)、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA(tRNA)以及其他的具有调节功能的非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）[13]，它们涉及各种各样的生物过程。与细胞核基因组在1 个有机体的一生中是相对稳定的,整体规模和组成是静态的这一发现不同，转录组是非常多变的。ncRNA 可以在转录后进一步影响基因的表达[14]。全转录组分析的目的是捕获编码和非编码RNA，量化细胞、组织、器官甚至整个机体中基因表达的异质性, 为DNA 测序揭示的基因及基因组的功能特性和注释提供先决条件[13]。转录组测序即RNA 测序（RNA sequencing, RNA-seq）, 是研究生理条件和疾病进展差异分子变化的有力技术，已成为一种常用于分析差异基因表达的分子生物学工具[15]。RNAseq 是通过高通量测序技术对转录物进行直接测序，它显示出很强的潜力，可以替代微阵列进行全基因组转录组分析。RNA-seq 在检测转录组精细结构如检测新的转录物、等位基因特异性表达和剪接连接等方面具有相当大的优势[16]。在这类研究中提出的一个典型问题是寻找在样本组之间有显著变化的基因，基因表达的变异可能是影响生理参数的一个重要的分子表型[17]。RNA-seq 可以检测转录水平，也可以揭示剪接异构体和表达多态性。

进行测序时首先需要分离和裂解单个细胞，通过3′端poly（A）尾来捕获真正的多聚腺苷酸化RNA，将其单链RNA 合成双链互补DNA (complementary DNA, cDNA)，并扩增cDNA 以生成高通量测序文库[18-19]。真核蛋白编码基因的转录始于在启动子DNA 上由RNA 聚合酶Ⅱ（Pol-Ⅱ）和一般转录因子组成的保守起始复合物。Pol-Ⅰ转录rRNA前体，Pol-Ⅲ转录小的非编码RNA，如tRNAs。Pol-Ⅱ则转录蛋白质编码基因以产生mRNAs[20]。目前研究人员已经可以通过多种途径来快速合成全长cDNA，例如酶工程以及以一些捕捉5′端的技术[21]。其产物的积累通过“实时”定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）的双标记荧光探针（即TaqMan 探针）来测量。这种技术提供非常准确和可重复的基因拷贝定量，从而实现更快速、更高通量的检测[22]。下一代测序(next generation sequencing,NGS)方法和技术的快速发展，使大规模的全转录组测序项目成为可能[14]，它彻底改变了基因组研究。使用NGS 可以在一天内完成整个人类基因组的测序，相对于传统的Sanger测序而言具有重大的独创性和颠覆性[23]。转录组学技术主要用来研究不同条件或疾病状态下的细胞或组织，以确定导致特定功能的基因或转录表达的变化[24]。深入的RNA 序列可提供大量的基因信息，可用于更详细地了解与人体肥胖相关的基因组和转录组[25]，进而了解肥胖发生的机制。

1.2 肥胖的发病机制 肥胖产生的根本原因是体内能量摄入和支出之间长期的不平衡。体质量的增加可能是由于能量摄入过多、体力活动过少和能量消耗过少的综合结果[2]。而这是环境因素与基因方面共同作用的结果。BMI 的遗传能力已被一致估计为40%～70%，表明约一半的个体间差异归因于基因，另一半个体间差异归因于环境[6]。大规模的全基因组关联研究（genome wide association study，GWAS）已经确定了近百个与BMI以及肥胖风险有关的基因变异[26]。携带风险等位基因拷贝的个体与没有携带风险等位基因拷贝的人相比，携带1 个或2 个等位基因拷贝的体质量分别增加1.2 kg 或3 kg[27]。脂肪量与肥胖相关基因（fat mass and obesity associated gene, FTO gene）的遗传变异已被确定是对人体BMI 影响最大的遗传因素，影响着脂肪细胞的发育、产热以及脂质的储存[28]。FTO 基因肥胖变异体可以通过破坏脂肪细胞中在能量平衡调节中起着因果作用的AT丰富结合域5B（AT-rich interaction domain 5B, ARID5B）与风险单倍体的结合起作用，阻断ARID5B 介导的发育调节因子易洛魁族同源蛋白（iroquois-class homeobox protein,IRX）3 和IRX5 的抑制作用而导致线粒体产热减少、脂质储存增加，进而导致肥胖[29]。然而肥胖作为一种复杂表型，单基因或者寡基因的改变并不能完全解释其发病机制，但可以通过了解与机体肥胖状态有关的基因网络，为临床治疗肥胖症提供干预靶点。

在高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型中，基因转录状态发生改变，下丘脑表达2 型囊状谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter type-2，Vglut2) 的谷氨酸能神经元发生相应改变[30]。Vglut2 神经元已被证实与BMI 具有显著关联。提示高脂饮食可以改变参与能量平衡的下丘脑神经元[31]。在对C57BL/6 小鼠分别饲喂对照、低脂饮食或高脂饮食后发现，小鼠的微生物生态学均发生了显著的饮食依赖性变化[32]，并且改变了核受体肝细胞核因子4 （hepatocyte nuclear factor4 ，HNF4 ) 反向转录程序，肥胖动物在这些位点上的HNF4 水平略高。HNF4 是最古老的核受体转录因子家族成员，已被证实在维持肠道对微生物群的稳态中发挥着关键的作用[33]。这些数据表明，饮食影响HFN4 在基因表达中的调节作用[34]。

高脂饮食诱导的肥胖对身体转录组学的改变不可以通过减肥来快速消除。研究人员通过对雄性恒河猴暴露于营养过剩和饮食热量限制后骨骼肌转录动力学的研究发现，尽管体质量显著下降，但大多数被高热量饮食上调的457 个基因和被高热量饮食抑制的47 个基因在热量限制后仍显著失调[35]。在对健康人体的试验中，更是佐证了这一观点：短暂暴露于高脂肪饮食会引入持续的DNA 甲基化标记。这种甲基化变化在6～8 周后只有部分逆转，且程度并不显著[36]。这提示应该防患于未然，控制好体质量，如果因肥胖导致了转录组发生改变将会使减肥变得异常困难。

2 针灸干预肥胖的研究

中医认为，肥胖的关键病机为大量食用肥膏厚味而致水湿痰浊壅滞，积郁体内，从而诱发肥胖。正如《素问·通评虚实论》所言:“肥贵人，则膏梁之疾也”。另有七情致病理论，认为忧郁之人时常气机不畅，而肝主疏泄，气机逆乱日久则损伤肝主疏泄的功能。肝气不达甚则横逆反胃，影响脾胃气机。脾胃气机不畅则导致水谷精微输布不利，形成痰浊湿邪积聚体内，最终导致肥胖的发生[37]。作为中国传统医学的重要组成部分之一的针灸疗法，因为其简单高效并且无明显不良反应而广泛应用于临床对肥胖症的治疗。其治疗大法以调理脾胃为主，发挥其健脾运湿、化湿降浊的功效。

而现代临床研究表明，针刺过程中引起了右背外侧前额叶皮质、前扣带回皮质和中脑激活，甚至影响了局部脑血流。针灸可能通过改变神经递质和神经激素的释放来改变大脑的化学反应，从而影响与感觉和非自主功能相关的中枢神经系统部分，例如调节自身血压、血流量和体温的过程[38]。另有研究证明，除了特定部位皮肤刺痛激活相关大脑区域之外，针灸还可能通过内脏感受通路来发挥其治疗效果；而且患者对治疗的期望和信念对大脑有生理影响，似乎介导了对针灸的潜在强大的非特异性临床反应[39]。在针灸干预肥胖过程中，可能通过针刺作用于中枢神经系统与肥胖有关的内分泌轴从而控制肥胖的发展，进一步的证据则需要更深一步的研究来证实[38]。

目前针灸治疗形式多种多样，有体针疗法、电针疗法、耳针疗法与温针灸等多种治疗手段，将针法、灸法与现代科技灵活运用，均在临床治疗肥胖相关的疾病中取得良好的效果。已有证据表明，采用针灸联合中成药补肾化瘀汤治疗肥胖型多囊卵巢综合征取得良好临床疗效，治疗后患者BMI 较治疗前明显下降，卵巢体积明显缩小[40]。相对西药如胰岛素增敏剂二甲双胍对胃肠道的刺激作用以及阻碍机体对维生素B12 的吸收等不良反应而言，针灸治疗有着显著的优势。不仅如此，针灸还可以改善重度肥胖伴高脂血症患者的肥胖程度和血脂水平，Huang 等[41]对264 例重度肥胖伴高脂血症患者进行针刺干预治疗，发现治疗组患者的肥胖症状获得了明显的改善。而将针灸与电学相结合的电针疗法更是在肥胖治疗过程中展现了令人瞩目的疗效。陈嘉欣等[42]对60 例肥胖型多囊卵巢综合征患者进行电针治疗，在经过12 周治疗后，患者体质量、BMI、腰臀比(waist-to-hip ratio, WHR) 均有显著改善(＜0.05)。电针联合拔罐疗法在治疗女性腹型肥胖方面取得显著疗效，为女性肥胖的治疗打开新思路[43]。电针不仅在治疗女性肥胖、调节雌性激素分泌方面获得显著效果，在肌肉减少型肥胖的老年男性（60 岁以上）群体也发挥了重要的作用。Zhou 等[44]对这一群体进行电针治疗后发现，为期12 周的电针治疗可以明显降低体脂以及提升骨骼肌指数。将针刺与艾灸相结合的温针灸治疗更是发挥了2 者的优势，在治疗肥胖中取得了显著的成效。50 例原发性高血压伴肥胖的患者在治疗后不仅收缩压、舒张压明显低于治疗前，其体质量指数、肥胖度等指标均获得明显改善(＜0.05)[45]。Zhang 等[46]对电针足三里穴位联合跑步机运动对饮食诱导的肥胖大鼠的转录组变化和相关机制进行了研究，其将大鼠分为5 组，包括对照组、饮食诱导肥胖组、电针组、跑步机运动组和电针联合跑步机运动组，结果显示，电针减轻了大鼠体质量和腹膜后白色脂肪/体质量的比值。对各组大鼠腹膜后的白色脂肪进行RNA-seq，差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）分析显示，对照组与肥胖模型组、肥胖模型组与电针组、肥胖模型组与跑步机运动组、肥胖模型组与电针联合跑步机运动组相比的DEG 分别为1 383、913、3 324 和2 794 个。对这些DEG进行基因本体（Gene ontology，GO）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，结果显示，电针联合跑步机运动主要调控过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路（peroxisome proliferator activated receptor signaling pathway）和钙信号通路（calcium signaling pathway）。本研究首次对肥胖大鼠腹膜后白色脂肪的转录组进行研究，以期为针灸治疗肥胖的作用机理提供了科学依据。

以上结果均表明，多种形式的针灸疗法在治疗肥胖症伴其他疾病过程中均发挥了重要作用，值得在临床上进一步推广。

3 小结

肥胖是一个重大的健康挑战，它大大增加了多种疾病的风险，如2 型糖尿病、脂肪肝、高血压、心脑血管疾病甚至癌症，从而导致生活质量和预期寿命的下降。预防和控制肥胖已经刻不容缓。作为中医治疗体系中具有重要地位的针灸疗法，其临床效果已经在治疗肥胖症的医疗实践中得到了肯定。针灸疗法可以有效阻止肥胖症的发展，恢复人体正常生理功能。但是针灸治疗肥胖的作用机理仍未完全阐明。转录组学测序技术在针灸治疗肥胖机理研究领域的应用对于阐明针灸治疗肥胖的机理和作用靶点具有促进作用，值得在今后的研究中进一步应用。