外泌体在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用

徐 昆， 石清兰， 胡振斌， 张 旭， 李 瑛

1 广西中医药大学 研究生院， 南宁 530222； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病一区， 南宁 530023

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在西方国家普通人群的发病率为20%～30%，在亚洲地区约为27.37%，而我国成人NAFLD的发病率在13%～43%[1-2]，并且呈逐年上升趋势。NAFLD的发病机制现尚未完全阐明，但与环境、代谢及遗传易感性等因素密切相关，囊括从单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化以及肝癌的一系列疾病[3]。外泌体是由多种细胞分泌的直径在40～100 nm的盘状膜性囊泡，携带蛋白质、脂质及核酸(miRNA、lncRNA和DNA)等活性成分，能介导细胞间的通讯，在多种生理病理过程中发挥重要作用[4]。本文就外泌体对脂质代谢，胰岛素抵抗(IR)、慢性炎症及肝纤维化的影响，探讨外泌体与NAFLD之间的关系，为NAFLD的发病提供一些新的见解。

1 外泌体简介

外泌体是胞内多囊泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的双层脂质囊泡，可通过多种应激条件诱导生成[5]。不同组织细胞来源的外泌体携带的蛋白质、脂质及核酸不同，其所发挥的生物学效应也不尽相同。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，以多种方式参与细胞间的通讯，包括直接的膜融合、受体介导的融合以及内吞作用，将生物活性物质输送至靶细胞并激活细胞内的信号通路，从而构成了细胞-细胞间的信息传递系统，在细胞通讯、免疫应答、细胞迁移、细胞分化等多种生理病理过程中承担重要作用[4]。NAFLD的发病机制复杂，糖脂代谢紊乱引起的肝脂肪蓄积是首要原因，而由此引发的肝脏慢性炎症及进行性肝纤维化则是其发展的重要因素。外泌体在NAFLD的发病、诊断和治疗中都发挥着至关重要的作用。

2 外泌体与脂质代谢

NAFLD以肝细胞的脂肪蓄积和脂肪变性为主要病理特征，脂质代谢紊乱被认为是NAFLD发生的首要原因。肝脏参与脂质代谢的许多重要环节，当体内的脂肪酸(FA)超过肝脏的处理能力后，过多的脂质将以甘油三脂(TG)的形式在肝细胞内沉积，引起肝脏脂肪变性[6]。诸多研究证实，外泌体对脂质代谢具有显著影响，其中包含的生物活性分子在调节脂质的合成及分化中起着重要作用。因此深入了解外泌体对脂质代谢的调节作用机制，对认识本病具有重要意义。

2.1 外泌体促进脂肪形成 哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)是脂质代谢的重要调节剂，已被鉴定为miR-199a-5p的靶基因。有研究[7]显示，在高脂饮食诱导的脂肪变性小鼠模型中，脂肪组织内高度表达的miR-199a-5p可经外泌体转运至肝脏，并通过抑制MST1的表达来影响SREBP-1c/AMPK信号级联，上调肉碱棕榈酰转移酶(CPT1)和脂肪酸合酶(FASN)的表达，随后刺激FA合成并抑制脂解途径，最终导致细胞脂质蓄积。而在肝脏中特异性表达的miR-122，则可通过与FASN和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的3′非翻译区(3′URT)高度结合，影响血浆中TG、游离脂肪酸(FFA)及胆固醇的含量，从而增加脂肪的生物合成[8]。抵抗素是由脂肪细胞分泌的一种特异性细胞因子，以脂肪细胞外泌体的形式运送至肝细胞，通过抑制AMPKα信号传导导致内质网应激并促进肝脏中TG的合成而加剧肝脂肪变性[9]。在低氧条件下，源自脂肪细胞的外泌体还会通过增加FASN、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)及ACC等脂肪合成酶的水平来促进脂质合成[8]。此外另有研究[10]表明，在肠黏膜严重损伤的小鼠中，高迁移率族蛋白1可由Toll样受体4(TLR4)信号激活，通过肠外泌体从受损的肠上皮细胞释放，以外泌体介导的非经典药物分泌途径分泌，通过作用于肝脏，导致肝脏脂肪变性。

2.2 外泌体影响脂肪分化和棕色化 外泌体是脂肪分化的重要调控因子，在诱导脂肪干细胞(ADSCs)分化为成熟脂肪细胞中起重要作用。Wnt-1诱导分泌蛋白2是由脂肪组织分泌的一种新型脂肪因子，在前脂肪细胞中高度表达，具有抑制脂肪生成的作用，而miR-450a-5p是脂肪细胞来源外泌体(Ad-Exo)中最丰富的miRNA之一。Zhang等[11]研究表明，当Ad-Exo被ADSCs内化后，其中富含的miR-450a-5p可通过与Wnt-1诱导分泌蛋白2的3′URT靶向结合来抑制其表达，从而促进脂肪分化。亦有研究[12]表明，无论是体外还是体内实验，用脂肪组织的外泌体样囊泡处理ADSCs时均可导致脂肪滴的出现，并且脂肪形成基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、aP2及脂联素的水平也会相应升高。外泌体同样可以通过调控白色脂肪棕色化来影响脂肪代谢。钟琼慧等[13]研究表明，ADSCs以外泌体的形式分泌miR-27并作用于脂肪组织，通过下调解耦联蛋白1、PPARγ、含PR结构域的锌指蛋白16及PPARγ共激活因子1α等棕色化相关蛋白抑制白色脂肪棕色化，从而增加脂质蓄积。此外不同组织细胞来源的外泌体中所富含的一些其他miRNAs(如miR-143、miR-192、miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-125b-5p等)在调控白色脂肪棕色化过程中同样也发挥了重要作用[8]。由上可知，外泌体内含有的多种功能性物质可通过不同途径影响脂肪代谢，对肝脏脂肪蓄积和脂肪变性起直接或间接的作用。

3 外泌体与IR

NAFLD的发生发展是多因素共同作用的结果，脂质异常蓄积导致的肝脏脂肪变性常常是疾病的启动因素，而IR则是NAFLD发展的核心环节[6]。脂肪组织作为一种高度动态的代谢器官，可通过分泌含有多种生物活性物质的外泌体来调节葡萄糖代谢和全身性胰岛素敏感性，此外脂毒性物质介导的巨噬细胞极化也是诱发IR的重要原因。

3.1 外泌体蛋白与IR Sonic Hedgehog(Shh)是一种外泌体蛋白，在脂肪细胞外泌体中高度表达，是控制巨噬细胞极化的关键因子。Song等[14]研究表明，携带Shh的脂肪细胞外泌体通过Ptch和PI3K途径刺激巨噬细胞M1极化，当M1巨噬细胞浸润到脂肪组织中后，可通过释放外泌体来降低脂肪细胞中胰岛素受体底物1和激素敏感性脂肪酶的表达，从而诱导IR。Deng等[15]进一步证明，M1巨噬细胞释放的外泌体是促炎细胞因子的重要来源，其中的TNF和IL-6可以阻断脂肪细胞中的胰岛素作用，而IR的产生很可能是通过TLR4/TRIF途径来完成的。Yuasa等[16]研究表明，与外泌体相关的钙蛋白酶2可直接作用于胰岛素受体并切割其β亚基，随后γ-分泌酶对β亚基进行下一步的膜内切割。两种酶对胰岛素受体的顺序切割在直接抑制胰岛素受体底物1的Akt磷酸化的同时也减少了酪氨酸的磷酸化，从而抑制胰岛素信号传导途径，导致IR的发生。另有研究[17]表明，高脂饮食小鼠肠道上皮细胞外泌体的脂质可发生明显改变，从主要的磷脂酰乙醇胺变为磷脂酰胆碱，当外泌体通过肠肝轴转运至肝脏后，外泌体磷脂酰胆碱结合并激活在肝细胞中表达的芳香烃受体(AhR，一种调节胰岛素反应的蛋白质)，导致激活胰岛素信号通路必不可少的基因(如IRS-2)及其下游基因PI3K/蛋白激酶B(Akt)被抑制，从而引发IR。

3.2 外泌体miRNAs与IR 外泌体中含有丰富的miRNA，可通过多种方式介导IR，在葡萄糖稳态中起着至关重要的调节作用。例如miRNA-93可通过抑制葡萄糖转运蛋白4的表达而导致IR[18]；miRNA-145可通过P65转录因子途径导致肝细胞IR[19]；miRNA-27a可通过抑制IRS1、Akt及糖原合成酶激酶3β的磷酸化来阻断胰岛素信号通路，通过靶向PPARγ的表达来介导IR等[20]。

沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1，SIRT1)是众所周知的胰岛素敏感基因，在IR中起重要调节作用。Su等[21]研究表明，老年小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源的外泌体中含有丰富的miR-29b-3p，当外泌体被脂肪细胞、肌细胞和肝细胞摄取后，其中的miR-29b-3p可与SIRT1 mRNA的3′URT直接结合并抑制其表达，通过miR-29b-3p/SIRT1依赖性方式介导IR。而另一项研究[22]也表明，在脂肪特异性SIRT1缺陷小鼠中，由自噬诱导释放的外泌体可通过TLR4/NF-κB途径损害胰岛素敏感性。线粒体功能障碍对IR的形成有着重要影响，NADH脱氢酶泛醌1α亚复合物4是线粒体呼吸链复合物Ⅳ(CⅣ)的一个组成部分，与线粒体功能密切相关。Tian等[23]研究表明，miR-210在高糖诱导的脂肪组织巨噬细胞衍生的外泌体中高表达，可通过抑制NADH脱氢酶泛醌1α亚复合物4基因的表达来影响CⅣ的活性，而CⅣ活性的受损可直接导致线粒体功能障碍，并通过β氧化途径减少脂肪酸分解并抑制ATP产生，从而导致β细胞功能障碍和诱发IR。此外miRNA-155、miRNA-144、miRNA-29b、miRNA-29a、miRNA-222、miRNA-141-3p等miRNAs在全身性IR及糖脂代谢中也起着重要作用。由此可知，外泌体携带的蛋白质及miRNAs在葡萄糖稳态和IR的调节中发挥了重要作用，弄清这些生物活性物质起作用的靶点及通路，不仅有助于认识疾病的发生发展，对今后NAFLD的诊断、药物开发和治疗同样具有启发。

4 外泌体与肝脏炎症

肝脏脂肪变性常常伴随着肝细胞的坏死和脂毒性物质的产生，由此引发的氧化应激和炎症反应则是NAFL向NASH进展的关键。巨噬细胞是脂肪驻留的免疫细胞中最丰富的类型，其数量和炎症反应密切相关。巨噬细胞具有高度的可塑性，从抗炎性M2型向促炎性M1型的转换过程中，会产生促炎细胞因子，从而加剧炎症反应[24]。而外泌体作为细胞间信息交流的载体，在脂毒性物质和巨噬细胞介导的炎症中扮演了重要角色。

既往研究表明，胆固醇是NASH发病机理中的关键脂毒性分子，可影响溶酶体、内质网等多种细胞器的功能。Zhao等[25]研究证明，过多的胆固醇会诱导溶酶体功能障碍并抑制多囊体的降解，使肝细胞释放的外泌体增加，其中包含的肝脏特异性miR-122-5p可直接作用于巨噬细胞，促进巨噬细胞的M1极化，导致炎性细胞因子分泌增加。因此，改善溶酶体功能或抑制miR-122-5p可能是NASH的潜在治疗策略。此外Liu等[26]研究发现，在高脂高胆固醇饮食诱导的大鼠脂肪性肝炎模型中，脂毒性肝细胞释放的外泌体可诱导CD11b+和CD86+巨噬细胞的激活，同时促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6和TNFα等炎性因子的释放。而外泌体中富含的miR-192-5p可抑制Rictor蛋白的表达，通过促进叉头框转录因子0亚族1的激活，来介导炎症反应的发生。另有研究[24]表明，在HFD喂养的小鼠中，成熟脂肪细胞分泌的外泌体高表达miR-34a，可经旁分泌的形式转运至巨噬细胞中，通过抑制Krüppel样因子4的表达来抑制M2极化，从而诱导全身性炎症的发生。

死亡受体5(DR5)信号通路在介导巨噬细胞的活化中也起着关键作用。Hirsoua等[27]证明，棕榈酸酯(PA，一种有毒的饱和游离脂肪酸)可通过CHOP/DR5/caspase8/3信号级联激活与锌离子相关的RhoA蛋白1，从而导致肝细胞来源的外泌体释放增加。外泌体中包含的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可与巨噬细胞表面的同源配体DR5相互结合，通过NF-κB信号通路将巨噬细胞激活为促炎表型，诱导促炎性细胞因子(IL-1β和IL-6)的表达和释放。此外亦有研究[28]证明，PA诱导的内质网应激，可通过IRE1a/XBP-1依赖性方式促进肝细胞外泌体释放，脂毒性外泌体所富含的C16∶0神经酰胺可介导1-磷酸鞘氨醇(S1P)的生成。S1P与巨噬细胞表面的1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR)结合后，可激活巨噬细胞的趋化性，将巨噬细胞募集到肝脏，导致肝脏炎症的产生。如上所述，外泌体介导的巨噬细胞活化和迁徙是肝脏炎症损伤的重要推动力量，这不仅加速肝细胞死亡，而且还促进了肝脏纤维化的发展。因此，深入研究两者的相互作用机制，抑制两者之间的信息交流，对延缓甚至阻断病情发展，具有至关重要的作用。

5 外泌体与肝纤维化

肝纤维化是慢性肝损伤期间细胞外基质(ECM)过度产生并沉积，导致肝脏结缔组织异常增生的一种病变过程，是NASH向肝硬化发展的必经之路[29]。肝星状细胞(HSC)的激活受多种机制调控，是纤维化发展的关键步骤[30]。活化的HSC可转化为成纤维细胞并向肝脏迁徙，释放大量ECM蛋白，导致肝纤维化的发生。越来越多的证据表明，外泌体在HSC的活化及肝纤维化的调控中起着重要作用。

活化的巨噬细胞不仅可以推动肝脏炎症的发展，还可以释放外泌体激活HSC，诱导纤维化的发生。Chen等[31]研究表明，源自脂多糖激活的THP-1巨噬细胞释放的外泌体可以靶向HSC，外泌体富含的miR-103-3p通过与Krüppel样因子4的3′URT结合而抑制其表达，从而诱导HSC增殖和活化。来源于HCV感染的肝细胞外泌体释放增加，其携带的miR-192被传递到HSC中，通过增加转化生长因子β1的表达，来诱导HSC的活化[30]。此外，肝lncRNA-H19水平与纤维化严重程度也密切相关。Liu等[32]研究表明，胆管细胞衍生的外泌体中高表达H19，可优先被HSC吸收。H19不仅增加G1/S细胞周期过渡来促进HSC的增殖和活化，而且在HSC衍生的成纤维细胞中上调了纤维化基因表达，促进ECM蛋白形成，从而诱导纤维化。另有研究[33]发现，用血管紧张素Ⅱ处理的人肝LX-2星状细胞中，促炎细胞因子(IL-1β、IL-18和TNFα)和ECM蛋白(α-SMA、ColⅠ和ColⅢ)表达增加。进一步研究发现，该结果的产生与凋亡信号调节激酶1(ASK1)有关，用ASK1抑制剂GS-4997或siRNA预处理能够逆转血管紧张素Ⅱ对LX-2细胞的影响。因此，从功能上抑制ASK1可能是治疗肝纤维化的一种潜在途径。

miR-122是肝细胞中含量最丰富的miRNA，占总miRNAs的70%。研究报道，miR-122在脂质代谢和肝纤维化中具有双重调控作用。在肝脏中，miR-122的高表达可以诱导脂质合成增加，而miR-122的低表达则可导致纤维化的发生。Csak等[34]研究表明，miR-122可在多个步骤中影响肝纤维化。首先，在肝细胞中，miR-122的减少可导致缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达增加，HIF-1α作用于其靶基因赖氨酸氧化酶，通过参与胶原纤维和弹性纤维的交联，促进ECM的形成。其次，miR-122的减少与促分裂原活化蛋白激酶3的增加有关，促分裂原活化蛋白激酶3与HIF-1α均可启动内皮-间质转化,诱导上皮细胞转化为成纤维细胞，促进肝纤维化的发生。最后，波形蛋白是HSC和成纤维细胞中细胞骨架的主要成分，miR-122的减少可促使波形蛋白表达增加，间接促进HSC的增殖和分化。所以，调节肝脏中miR-122的表达，对肝纤维化和脂质代谢均具有重要意义。

6 小结

综上所述，多种细胞来源的外泌体通过靶向释放蛋白质、miRNA及lncRNA等生物活性分子介导细胞间信息传导，在NAFLD的发生和发展中发挥重要作用。因此，阻断致病性外泌体的分泌及其内容物的释放可能在NAFLD的治疗过程中获益[4]。此外，由于其稳定的双层脂质结构，外泌体也可作为药物运送的载体，参与疾病的治疗[35]。在诊断方面，外泌体也显示出了巨大的优势，其中所包含的miRNAs与疾病进展呈正相关[36]，可作为肝脏疾病的新型生物标志物。但就目前而言，外泌体所包含的生物活性分子及其与受体细胞的相互作用机制尚未完全阐明，作为一种新的治疗和诊断工具尚处于开发的早期阶段，从动物实验到临床运用，还需要进行更多的研究[5]。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：石清兰、胡振斌负责课题设计，修改论文，指导撰写文章并最后定稿；徐昆负责拟定写作思路，资料分析，撰写论文；张旭、李瑛负责收集整理数据。