黑色素瘤缺乏因子2在肝脏疾病中的作用机制及临床意义

乐滢玉， 张荣臻， 王挺帅， 陈宁芳， 毛德文

1 广西中医药大学 研究生院， 南宁 530222； 2 广西中医药大学第一附属医院 a.肝病一区, b.脾胃一区， 南宁 530023

固有免疫应答是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线，在宿主识别、抵抗病原体感染中扮演者重要角色。免疫系统除了抵御病原体之外，对源自组织或细胞损伤的相关信号亦能作出应答。目前研究认为[1]，固有免疫系统细胞识别受体存在两种模式：病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) 和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)。免疫细胞通过病原体源性信号的识别激活称为PAMP，宿主源性信号的识别激活通常被称为DAMP，而以上信号均由模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别介导。根据其细胞定位的差异，PRRs分为膜结合型PRR和胞浆型PRR。膜结合型PRR包括Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)，而胞浆型PRR包括NOD样受体(NLR)、视黄酸诱导基因-I样受体(RIG-I样受体)和黑色素瘤缺乏因子2 (absentinmelanoma 2，AIM2)样受体(AIM2-like receptors，ALR)[2]。这些受体的配体特异性及其信号级联反应的特征相对较好。其中，NLR和ALR是唯一能够诱导炎症小体组装和活化的受体，而炎症小体可以激活炎性caspases并导致炎性细胞因子(如IL-1β和IL-18)分泌，以及诱导细胞凋亡。炎性细胞因子的产生和细胞焦亡对肝脏具有重要的生物学效应，包括炎症级联反应的放大[3]。虽然以往对炎症小体活化在肝脏疾病中的作用已有较多报道[4-7]，但其多数研究集中于NLR相关的炎症小体，尤其是NLRP3(NLR家族，含3个吡啶结构域)炎症小体。近年来随着研究的深入，炎性小体AIM2在肝脏疾病中的作用机理及其临床意义已日趋成为当下研究的热点，本文就AIM2在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、HBV感染、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)等肝脏疾病发病机制中的重要性进行归纳和探讨，以期为其临床治疗提供新的思路和参考。

1 AIM2生物学特征

AIM2是细胞质双链DNA(dsDNA)感应蛋白，可识别在细胞扰动和病原体侵袭期间释放的双链dsDNA，并触发炎性体级联反应的激活，在天然免疫防御中发挥重要作用。炎性体的激活会导致炎性细胞因子(IL-1β，IL-18)的成熟释放，诱导细胞焦亡，启动固有免疫应答。AIM2在结构上由两个主要结构域组成：N末端pyrin结构域(PYD)和C末端HIN结构域。HIN结构域是寡核苷酸/寡糖结合的结构域，能够与核酸、寡糖和蛋白质识别，并与胞质溶胶中的dsDNA结合，参与DNA复制、重组、修复及端粒保持等过程。PYD是死亡结构域折叠家族的成员，其在进化上高度保守，参与蛋白质间的相互作用和下游信号的传递，普遍存在于细胞凋亡和炎症相关的蛋白质中。

目前，控制AIM2激活初始步骤的结构机制尚存在争论，其主要存在两种假说。假说一：在缺失dsDNA的情况下，HIN和PYD结构域彼此相互作用，从而使蛋白质保持自动抑制状态[8]。结合域HIN是由带正电的HIN结构域残基和dsDNA糖磷酸主链之间的静电相互作用介导[9]，从而使PYD从HIN域中释放出来，并与下游适配器发生相互作用。假说二：PYD的作用并非始终保持自动抑制状态，当细胞浓度高达近10 000倍时，AIM2可以发生自组装，促使PYD与接头蛋白ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) 结合，从而驱动AIM2炎性小体形成[10]。

ASC是由PYD和CARD组成的二元结构，而多个ASC分子的聚集会导致大片ASC斑点形成，并由于CARD-CARD相互作用而募集Pro-caspase-1分子。Pro-caspase-1分子自动裂解产生一个p20和p10亚基，两个p20和两个p10亚基形成一个活性异四聚体(活性caspase-1)[11]。活性caspase-1具有双重功能：其一，裂解pro-IL-1β和pro-IL-18 并促进IL-1β和IL-18细胞因子的成熟和分泌；其二，加工修饰GSDMD蛋白并释放N端片段[12]，与质膜相互作用并促使膜孔的形成，从而诱导IL-1β、IL-18的成熟和释放，并诱导炎性细胞凋亡和释放细胞内容物[13]。

2 AIM2炎性小体的调节

值得注意的是，炎性小体肆意的激活会导致慢性炎症和自身免疫性疾病。因此，炎性小体的微调稳态在疾病的发生发展中至关重要。ASC的翻译后修饰在炎性体的激活中扮演着重要角色，例如磷酸化、泛素化，其可调控AIM2炎性体的活化和降解[14-15]。此外，诱饵蛋白也可以通过干扰炎症小体的组装或限制配体的可用性从而参与炎症小体的调控，此过程中PYD-only蛋白(POP)和CARD-only蛋白(COP)发挥着关键作用。目前，在人类中已经发现3种POPs(分别为POP1、POP2和POP3)，其中POP3含有HIN-200 PYD特异性序列基序，并与AIM2的PYD具有高度同源性。研究[16]表明，POP3能够通过与ASC竞争AIM2中的PYD结合位点来破坏ALR/AIM2炎性体复合物的组装，进而抑制炎性小体活化和形成。COP的作用机制与POP类似，通过抑制 CARD-CARD相互作用参与调节。迄今为止，人们发现的3种COPs(CARD16、CARD17和CARD18)均编码于人类基因组的caspase-1位点，其与caspase-1的CARD结构域高度同源，并通过阻止caspase-1向炎症小体的招募而发挥作用。

HIN-200蛋白p202是ALR家族的另一种诱饵蛋白，其因缺少PYD结构，仅由两个HIN域组成，又称为“HIN-only蛋白”，可以抑制小鼠的AIM2炎性体而无法募集ASC。一个HIN结构域(HIN-1)与dsDNA相互作用，而另一个HIN结构域(HIN-2)与AIM2的HIN有较强的亲和力[17-18]。因此，p202抑制AIM2可能存在两种机制。机制一：p202可能与自身的HIN-1竞争DNA，从而限制自身对AIM2的可用性，同时还可能会抑制其他胞质DNA传感器。机制二：p202直接与AIM2相互作用。研究[18]表明，HIN-2与AIM2的HIN发生物理相互作用，从而防止ASC聚集和caspase-1的募集。

3 AIM2在肝脏疾病中的作用

3.1 AIM2与NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 近年来，随着人们饮食结构的改变以及生活水平的提高，NAFLD的患病率不断升高。目前，全球发病率高达25.2%，亚洲发病率约为27%，其中至少有10%将会发展为肝硬化或HCC，从而使NAFLD成为终末期肝病的主要原因之一[19]。NASH是NAFLD更为严重和具有临床意义的阶段，临床表现为肝细胞损伤、脂肪变性和炎症，可能发展为终末期肝病和HCC。迄今为止，NASH具体的分子机制尚未完全明晰，但炎性活化和IL-1β释放似乎在其过程中发挥着重要作用。TLR4和TLR9通过髓样分化初级反应基因88(MyD88)的激活和通过炎症小体激活产生的IL-1β导致脂肪性肝炎。目前，有关探讨AIM2在NAFLD小鼠模型中的意义的研究较少，其真实世界的人体研究更是缺乏。在一项关于NASH的蛋氨酸-胆碱缺乏症小鼠模型的研究[20]发现，NASH与AIM2表达上调以及NLRP3炎性小体激活有关。NASH中炎症小体基因的上调和IL-1β mRNA的诱导是依赖于髓系分化因子88(MyD88)信号传导的调节。在NASH中MyD88的缺陷会削减AIM2、NLRP3、pro-IL-1β mRNA以及IL-1β蛋白水平的上调。此外，NASH中TLR9配体高迁移率族蛋白1(HMGB1)的水平也明显升高。HMGB1是一种高度保守的核非组蛋白，其通过激活TLR家族的各个成员(TLR2、TLR4和TLR9)在受损细胞中发挥内源性危险信号的作用[21]。因此，在NAFLD中HMGB1-TLR轴可能是AIM2上调的重要原因之一。另一项研究[22]表明，长期高脂饮食的雄性小鼠中AIM2炎性小体成分的mRNA表达水平升高，并诱发雄性小鼠NASH的发生发展。Gong等[23]发现，AIM2基因敲除(AIM2-/-)小鼠与野生型(WT)对照相比空腹血糖和胰岛素水平升高，并且AIM2-/-小鼠在腹腔进行葡萄糖耐量试验后出现葡萄糖耐受不良现象。经RNA测序显示，p202的IFN诱导型基因Ifi202b表达显著上调，并在AIM2-/-小鼠的性腺白色脂肪组织中炎症信号升高。因此，证明了p202在介导AIM2-/-小鼠脂肪形成和炎症增加中起关键作用。AIM2和p202可用作治疗人类肥胖症和相关代谢综合征的潜在药物靶标。

3.2 AIM2与HBV感染 HBV感染是世界上最常见的慢性病毒感染。HBV感染在全世界范围内广泛流行，HBV感染的流行强度因地域不同而表现出明显的差异。据报道[24]，全球慢性HBV感染人数约有2.57亿，其中西太平洋地区和非洲地区占比高达68%。亚洲HBV地方性流行程度不尽相同，多数亚洲地区均为中高流行区，少数为低流行区。全球每年约有88.7万人因HBV感染的相关疾病导致死亡，其中肝硬化占30%，HCC占45%。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV所致者分别为77%和84%。

HBV是一种可感染人类肝细胞的非细胞性包膜病毒。它包含一个约3.2 kb的环状DNA 和部分dsDNA基因组，该基因组在肝细胞核转化为共价闭合环状DNA(cccDNA)，作为病毒复制的转录模板。由于HBV感染导致的肝细胞损伤是通过针对病毒抗原的免疫反应介导的，同时AIM2是触发炎性体级联反应的dsDNA受体。因此，AIM2可能是参与HBV相关肝细胞炎症反应的重要致病因素之一。

庞秀青等[25]探讨了AIM2 在慢性乙型肝炎(CHB)患者肝脏组织中的表达分布及其与肝组织病变程度的相关性。结果表明，AIM2表达定位于肝实质细胞的胞质内，其在正常肝组织极少表达，但在CHB患者肝组织表达显著增加，且随肝脏炎症的加重而表达增强。患者肝脏组织AIM2积分吸光度值中位数在HBV-慢加急性肝衰竭组为19 772.48，其显著高于CHB组的4 996.88(Z=5.008，P<0.001)；CHB组显著高于健康对照组的2 296.49(Z=-3.028，P=0.002)；患者肝组织AIM2表达水平与肝脏炎症HAI评分正相关(r=0.707，P<0.001)。Wu等[26]研究了急性乙型肝炎(AHB)和CHB患者不同临床阶段外周血单个核细胞(PBMC)中AIM2的表达情况。研究结果表明，与CHB中的表达相比，AHB中AIM2、IL-1β和IL-18的表达更高。在免疫清除期的AHB和CHB患者中，AIM2 mRNA的表达与血清HBV DNA负荷、HBeAg呈显著负相关，与IL-1β和IL-18呈显著正相关。因此，AIM2的表达与宿主体内HBV的免疫清除率相关。近期一项研究[27]报道，AHB和CHB患者的PBMC中AIM2样受体IFI16的表达水平上调。Han等[28]比较了CHB和慢性丙型肝炎患者肝脏活检中AIM2蛋白的表达。结果表明，CHB患者中AIM2的表达显著增加并与HBV DNA负荷高度相关，而并非受血清HBeAg水平的影响。CHB患者中AIM2的表达水平(89.4%)显著高于慢性丙型肝炎患者(8.7%)，并且在CHB患者中，高HBV复制组(HBV DNA≥1×105拷贝/mL)中AIM2的表达显著高于低HBV复制组(HBV DNA <1×105拷贝/mL)，提示高HBV DNA负荷会导致AIM2表达增加。此外，AIM2的表达与CHB相关的炎症活性高度相关，而与纤维化程度无关[28]。AIM2水平与CHB患者中caspase-1、IL-1β和IL-18的表达呈正相关。在对入侵微生物的先天免疫反应过程中，HBV DNA与AIM2的结合可能导致caspase-1的活化，诱导IL-1β和IL-18的释放，进而在CHB的发病中起重要作用。此外，AIM2在HBV相关性肾小球肾炎(HBV-GN)中的作用意义也有所报道[29]，HBV-GN活检组织中AIM2表达水平(81.4%)显著高于慢性肾小球肾炎(4.0%)，并且与HBV-GN中HBV DNA负荷、caspase-1和IL-1β表达呈正相关。因此，AIM2炎性体激活可能会导致或加速HBV感染期间的肾脏炎症的发生。

3.3 AIM2与肝纤维化、肝硬化 肝纤维化是由慢性肝损伤导致组织瘢痕形成和炎症的过程，可进一步发展为终末期肝硬化和HCC。进行性肝纤维化多由病毒性肝炎、酒精性肝病和NASH等疾病引起，以肝脏中细胞外基质过多沉积为特征。据统计，全球肝纤维化患者约有1%～2%，每年因肝纤维化死亡人数超过100万人[30-31]。肝星状细胞在细胞外基质沉积和肝脏纤维形成中发挥核心作用[32]。当发生严重的瘢痕形成时，纤维化会进展为肝硬化并引发严重的肝功能损害。即使此过程较为缓慢，但一旦发生肝硬化将可能会出现一些危及生命的并发症，如自发性细菌性腹膜炎、肝性脑病、腹水等。

慢性炎症在肝纤维化和肝硬化的发生发展中起着关键作用，炎症小体在肝纤维化形成过程中的作用机理也已成为当下研究的热点，尤其是炎症小体的活化在肝硬化相关并发症的炎症反应中扮演的角色。研究[33-34]表明，肝硬化患者腹水巨噬细胞中caspase-1和AIM2的表达水平显著高于血液巨噬细胞，AIM2表达水平的上调使得腹水中的巨噬细胞促使dsDNA产生大量的IL-1β和IL-18，而NLRP3、NLRP1和NLRC4的表达没有明显差异。最新一项研究[35]表明，布鲁菌感染可通过激活NLRP3和AIM2炎性小体诱导肝星状细胞分泌IL-1β，并且布鲁菌感染是依赖于功能性T4SS的存在机制以及caspase-1、NLRP3的参与共同诱导IL-1β分泌。值得注意的是，与布鲁菌感染的WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的肝纤维化明显减少。因此，炎性体NLRP3和AIM2在布鲁菌感染期间的肝纤维化调节中起关键作用。研究[36]表明，在曼氏血吸虫感染的小鼠肝脏中，AIM2 mRNA和蛋白表达增加。此外，曼氏血吸虫的可溶性卵抗原可诱导Huh-7肝癌细胞中AIM2炎性体途径的激活以及AIM2 mRNA的表达。但是，AIM2激活是否有助于血吸虫病期间的肝纤维化的形成仍然需要进一步的研究证实。

3.4 AIM2与HCC 原发性肝癌是目前我国第四大常见恶性肿瘤，并且是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其病死率在所有肿瘤中排名第二。迄今为止，HCC是最常见的原发性肝癌，约占所有病例的85%～90%[37]。由于该病起病隐匿、病情迅猛、恶性率及病死率高等特点，故给患者的经济及社会医疗带来沉重负担。HCC病因主要包括HCV或HBV感染、酗酒、NASH，其中高达84%HCC患者是由HBV感染所致。通常慢性肝脏炎症伴随着HCC发生发展的整个过程，因此，由炎性小体介导参与肝癌发病的机制已成为众多学者研究的重点。

马小敏等[38]开展了一项关于AIM2对HCC作用效应以及其分子机制的研究，结果表明：与正常肝组织相比，AIM2在肝癌组织中mRNA及蛋白的相对表达水平明显下调，且其表达水平与肿瘤体积、大小、临床分期和病理分级等疾病相关的临床指标呈显著性负相关。体外过表达AIM2能够促进AIM2-ASC-Caspase-1炎症小体复合物的形成，并通过炎症小体的活化，抑制mTORC1信号通路的活化，而进一步发挥抑癌效应；相反，抑制AIM2的表达则可促进肝癌细胞的恶化。上述结果也与陈洪涛等[39]、Chen等[40]的体外实验结果相符。因此，通过上调AIM2的表达以及开发靶向mTORC1信号通路的药物为AIM2缺失表达相关HCC的治疗提供了新思路。同作者的其他研究表明[41]，肝癌细胞中AIM2的外源性过表达降低了移植肿瘤的生长，并伴随着mTOR-S6K1途径的减少。在体外，AIM2表达抑制HCC细胞系的增殖和集落形成。但是，Chen等[40]的研究结果并非如此，他们认为HIM细胞系中的AIM2过表达或沉默不影响细胞增殖。Martínez-Cardona等[42]使用二乙基亚硝胺(DEN)构建大鼠动物模型，研究了AIM2对肝癌发生发展的影响。令人惊讶的是，该模型中AIM2或caspase-1/11基因失活可防止HCC的发展。尤其是在肝癌发生的早期阶段，AIM2缺乏似乎显得尤为重要。DEN给药48 h后，AIM2-/-小鼠肝脏的急性肝细胞损伤、炎症和增殖标志物的表达均得到改善。AIM2缺乏也与肝脏中caspase-1激活和IL-1β生成的减少有关，这表明AIM2在DEN诱导的肝脏损伤中有助于炎症小体的激活。AIM2蛋白和mRNA在肝Kupffer细胞中高表达，并在AIM2刺激下产生大量的IL-1β。值得注意的是，当从DEN处理的小鼠肝脏中分离出Kupffer细胞时，IL-1β的产生仍进一步增加，其提示了致癌性肝损伤可能对细胞中的AIM2激活起促进作用。

综上所述，AIM2在HCC中的利与弊均有所报道。AIM2在这些研究中截然不同的作用看似格格不入，其实反映的是AIM2在不同疾病阶段(晚期HCC vs早期HCC)或不同细胞类型(HCC细胞vs非实质肝免疫细胞)中作用的差异。因此，AIM2可能根据肿瘤的类型(鳞状细胞癌、结直肠癌、HCC)、疾病的病因、被激活的细胞类型、疾病的阶段和炎症小体的参与而发挥不同的作用，但尚需更多的研究进一步论证和探讨。

4 小结与展望

AIM2作为一种DNA敏感型炎性小体，不仅在固有免疫应答中发挥重要作用，而且在不同肝脏疾病的发生发展中扮演重要角色。目前，AIM2仅在部分肝脏疾病中的作用及其分子机制得以阐述，但仍未完全明晰，有待进一步深入的研究以明确更多的功能和机理。并且，AIM2在其他肝脏疾病的表达机制及临床意义的相关研究少有报道，尚需对该领域进一步深入探索，以期为肝脏疾病的临床防治提供新的策略和实验支撑。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：乐滢玉负责拟定写作思路，撰写文章；毛德文负责研究选题，指导文章撰写；张荣臻、陈宁芳负责设计论文框架，起草论文；乐滢玉、毛德文、王挺帅负责修订论文。