盐度胁迫对河蚬摄食率及鳃ATP酶活力变化研究

包 锬，刘一萌，来琦芳，么宗利，周 凯，高鹏程

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，盐碱水域渔业工程技术研究中心，上海 200090）

我国约有4.6×105km2的低洼盐碱水域和约占全国湖泊面积55%的咸水湖泊［1］，近年来利用盐碱水开展水产养殖逐渐增多。贝类以摄食水中的藻类和有机碎屑为主［2-5］，在盐碱水域混养贝类对盐碱水的利用具有积极意义。盐度是盐碱生境中最主要的胁迫因子，也是水生动物面临最常见最主要的环境因子之一，在盐碱水环境生活的贝类会受到盐度带来的胁迫。

双壳贝类在受到胁迫时会将壳紧闭以尽量减少机体与外界环境中的离子交换，这种保护机制在砂海螂（Mya arenaria）、浅沟蛤（Scrobicularia plana）、紫贻贝（Mytilus edulis）、鸟蛤（Cardium edule）、硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、泥蚶（Tegillarca granosa）、魁蚶（Anadara broughtonii）、毛 蚶（Scapharca subcrenata）等双壳贝类中均有发现［6-9］。由于双壳贝类闭壳可以存活很长时间，且很难观察其生存情况，因此急性毒性实验无法快速判定双壳贝类对胁迫的耐受能力，如何选择快速有效的实验方法科学评价其对胁迫的耐受性能，需要进行相关探究。

摄食率（ingestion rate）可以反映滤食性贝类生理活动情况，常作为贝类受到胁迫时生物能量方面的重要参数［10］；盐度变化伴随着Na＋、K＋、Mg2＋和Ca2＋等阳离子和Cl-、、和等阴离子的浓度变化，鳃作为主要离子和渗透调节器官，鳃ATP酶在受到盐度胁迫时发挥着重要作用。Na＋／K＋-ATP酶，又称钠钾泵（sodium-potassium pump），正常状态下与质膜内侧Na＋、Mg2＋结合后被激活，使ATP分解，每分解1个ATP分子运进3个Na＋和2个K＋［11-12］。有研究表明，盐度发生变化时岩扇贝（Crassadoma gigantea）、泥蚶、魁蚶、文蛤（Meretrix meretrix）、青蛤（Cyclina sinensis）等双壳贝类鳃Na＋／K＋-ATP酶均有显著变化［8-9，13-15］。Ca2＋-ATP酶，又称钙泵（calcium pump），受到盐度胁迫时能将Ca2＋从细胞质基质中逆浓度梯度运送到细胞外或者内质网腔，使细胞质基质中Ca2＋浓度保持在低水平，这一过程与肌肉放松有关［12］。EKA等［16］认为，Mg2＋-ATP酶的底物是MgATP，游离ATP和Mg2＋是具有双重作用的酶修饰剂，Mg2＋-ATP酶每分解1个ATP转运1个Mg2＋。许多研究证明，盐度变化与水生动物Na＋／K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶以及Mg2＋-ATP酶的活力变化具有相关性［17-20］。

河蚬（Corbicula fluminea）是一种常见的淡水广盐性双壳贝类，隶属于软体动物门（Mollusca），瓣 鳃 纲（Lamellibranchia），真 鳃 瓣 目（Eulamellibranchia），蚬科（Corbiculidae），蚬属，在淡水、湖泊、河口潮间带等水域有广泛分布，对盐度变化有较强的适应能力。本文以河蚬为实验对象，模拟不同盐度胁迫，观察河蚬摄食率、鳃Na＋／K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶和Mg2＋-ATP酶的活力变化，评估河蚬的耐盐性能，筛选适宜评价贝类耐盐性能的指示指标，探索双壳贝类胁迫耐受性能评价方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其暂养

实验用河蚬采自江苏东台河道（120°33′E、33°26′N），使用500 L聚乙烯塑料桶进行暂养1个月以上，持续充气，每天更换经曝气24 h的过滤自来水，换水量为三分之一，水温（20.5±0.2）℃，pH（8.06±0.07），溶氧（6.65±0.34）mg·L-1，每天上午和下午各投喂一次球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、叉鞭金藻（Dicrateriasp.）和角毛藻（Chaetocerossp.）按1∶1∶1富集后的混合物。挑选壳长（3.44±0.35）cm、壳宽（2.75±0.13）cm、壳高（1.80±0.12）cm的个体用于后续实验。

1.2 摄食率实验

1.2.1 盐度设置

实验设置8个盐度梯度，分别为盐度3、5、8、10、13、15、20和25，以淡水为对照组，另外本实验还设置了无贝对照组，以消除藻类繁殖和沉降对藻类计数的影响。实验用淡水为经净水器（开能，AC／KDF-150 C型）过滤的自来水，盐度实验用水由海水素（青岛海科通用海水素有限公司）和过滤自来水配制而成。每个处理组设置3个平行。

1.2.2 实验管理

实验在聚乙烯塑料箱（37.5 cm×27.5 cm×14.0 cm）中进行，实验水体为10 L，每个处理组投放河蚬3个。河蚬在实验水体中稳定3 h后开始实验。每个处理组投喂混合藻类（球等鞭金藻、叉鞭金藻和角毛藻），水体藻类浓度为（3.5±0.3）×104个·mL-1，实验持续24 h，每小时用吸管随机取样5 mL后用鲁戈氏液固定，光镜下用血球计数板对藻类计数，重复3次。实验结束后将河蚬软体部取出并在60℃烘箱中烘干至恒重（精确到0.001 g）（表1）。

表1 摄食率各组河蚬软体平均干重Tab.1 Average dry weight of Corbicula fluminea in each ingestion rate test group

1.2.3 摄食率计算

藻类浓度变化系数（S）根据下式计算：

式（1）中：t为实验时间（h），Cc0为无贝组水体中藻类的初始浓度（个·mL-1），Cct为t小时后无贝组水体中藻类浓度（个·mL-1）。

河蚬摄食率（R）根据下式计算：

式（2）中：R为摄食率（个·h-1），V为实验水体量（L），N为实验贝个数，Ce0为实验水体中藻类的初始浓度（个·mL-1），Cet为t小时后实验水体藻类浓度（个·mL-1），S为无贝组藻类浓度变化系数，由式（1）计算所得。

为消除河蚬个体质量对摄食率的影响，将获得的数据通过下式转换为1 g标准下的摄食率（Rs）：

式（3）中：Rs为1 g标准下的值［个·（g·h）-1］；W为软体干重（g）；b为重量指数，参照吕昊泽等［21］的研究，取0.62；R为摄食率（个·h-1），由式（2）计算所得。

1.3 酶活实验

1.3.1 盐度设置

参照河蚬摄食率结果，选取3个盐度梯度，分别为5（S5）、15（S15）和25（S25）。设置淡水为对照组（control），实验用水同1.2.1。每个处理组设置3个平行。

1.3.2 实验管理

实验在聚乙烯塑料箱中进行，实验水体为10 L，每个梯度设置3个重复，每个处理组投放河蚬10个。实验期间每天投喂混合藻类2次，水体藻类浓度为（3.5±0.3）×104个·mL-1，并在投喂后3 h进行换水，换水量为三分之一，持续胁迫7 d。每天随机选取各盐度组中3个河蚬个体，参照林岗等［22］实验方法采集新鲜鳃组织样品制成2%组织匀浆，-80℃保存，待测。ATP酶活力单位定义：每小时每毫克蛋白分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，即μmolPi／mgprot／hour（U·mgprot-1）。具体操作参照南京建成生物工程研究所的考马斯亮蓝试剂盒（A045-2）和ATP酶试剂盒（A016-1）说明书。

1.4 数据统计与分析

运用统计软件SPSS 20进行统计分析，用one-way ANOVA进行单因素方差分析，若差异显著，用Tukey检验进行多重比较，分析显著性水平为P＜0.05，极显著性水平为P＜0.01。所得数据以3个平行组数据的平均值±标准差表示，并使用Origin9制图。

2 结果与分析

2.1 盐度胁迫对河蚬摄食率的影响

如图1所示，河蚬摄食率随盐度的升高而下降。多重比较后发现，盐度3组摄食率与对照组相比无显著差异（P＞0.05），盐度5、15和25组河蚬摄食率均有极显著降低（P＜0.01）。分别为2.11×108个·（g·h）-1、1.09×108个·（g·h）-1和7.68×107个·（g·h）-1。

图1 盐度胁迫下河蚬摄食率的变化Fig.1 Changes of ingestion rate of Corbicula fluminea under salinity stress

2.2 盐度胁迫下河蚬鳃Na＋／K＋-ATP酶活力变化

与对照组相比，不同盐度胁迫下盐度5和15组Na＋／K＋-ATP酶活力变化趋势相似，1 d时酶活力极显著降低（P＜0.01），之后逐步上升至4 d达到最高（P＜0.01），分别为8.53 U·mgprot-1和7.30 U·mgprot-1。从5 d开始，酶活力恢复到初始值附近，并保持稳定（P＞0.05）；盐度25组虽然在1 d时酶活力也极显著降低（P＜0.01），之后均与各组相比无显著差异（P＞0.05），7 d时出现大量死亡，存活率仅19%（图2），存活的河蚬酶活力基本稳定在初始值附近（图3），其余各组在各时间点内均没有出现死亡现象。

图2 盐度胁迫下河蚬的存活率Fig.2 Survival rate of Corbicula fluminea under salinity stress

图3 盐度胁迫下河蚬鳃Na＋／K＋-ATP酶的活力变化Fig.3 Changes of Na＋／K＋-ATPase activity in gill of Corbicula fluminea under salinity stress

2.3 盐度胁迫下河蚬鳃Ca2＋-ATP酶活力变化

与对照组相比，不同盐度胁迫下盐度5和15组Ca2＋-ATP酶活力变化趋势相似，2 d时酶活力极显 著 降 低（P＜0.01），分 别 为3.04 U·mgprot-1和3.28 U·mgprot-1，之后逐步上升，4 d时达到峰值，分别为6.26 U·mgprot-1和6.66 U·mgprot-1，7 d时恢复到初始值附近（P＞0.05）；盐度25组除1 d、2 d和5 d时极显著降低（P＜0.01），其余时间点酶活力均在初始值附近（P＞0.05）（图4）。

图4 盐度胁迫下河蚬鳃Ca2＋-ATP酶的活力变化Fig.4 Changes of Ca2＋-ATPase activity in gill of Corbicula fluminea under salinity stress

2.4 盐度胁迫下河蚬鳃Mg2＋-ATP酶活力变化

与对照组相比，不同盐度胁迫下盐度5和15组Mg2＋-ATP酶活力变化趋势相似，1 d时酶活力极显 著 降 低（P＜0.01），分 别 为5.07 U·mgprot-1和4.55 U·mgprot-1，4 d时极显著升高并达到峰值（P＜0.01），分别为9.91 U·mgprot-1和8.64 U·mgprot-1，从5 d开始，酶活力恢复到初始值附近，并保持稳定（P＞0.05）；盐度25组除1 d和3 d时极显著降低（P＜0.01），其余时间点酶活力均稳定在初始值附近（P＞0.05）（图5）。

图5 盐度胁迫下河蚬鳃Mg2＋-ATP酶的活力变化Fig.5 Changes of Mg2＋-ATPase activity in gill of Corbicula fluminea under salinity stress

3 讨论

3.1 盐度胁迫对河蚬摄食率的影响

本实验结果表明，河蚬摄食率与盐度呈负相关。河蚬在进行盐度胁迫时，摄食率在盐度5、15和25出现了相较于上一盐度极显著下降的现象。盐度5组摄食率相较于对照组下降了18%，推测盐度5对河蚬产生了胁迫；盐度15组河蚬摄食率相较于对照组下降了58%，背角无齿蚌（Anodonta woodiana）［23］在盐度10胁迫下摄食率下降约50%，并开始出现死亡现象，虽然河蚬盐度15胁迫7 d未出现死亡现象，但盐度25胁迫下河蚬摄食率极低，7 d后出现大量死亡现象，推测盐度25已超出河蚬耐盐极限，河蚬耐盐临界值在盐度15附近。盐度胁迫下由于贝类闭壳，导致摄食率下降，当摄食率下降超过50%时，提示着该盐度已超出贝类盐度耐受范围。另外，海水贝类文蛤和青蛤［24］在经过盐度5急性胁迫后摄食率相较于盐度15和20组也严重下降，因此摄食率是可以作为比较快速地体现双壳贝类耐盐性能的生理指标，摄食率下降比例与耐盐范围有一定相关性。

3.2 盐度胁迫对河蚬鳃ATP酶的影响

本实验中，鳃Na＋／K＋-ATP酶活力升高后恢复至正常水平，推测部分水生动物在高盐胁迫后，可以通过Na＋／K＋-ATP酶活力在4 d左右时升高，积极进行离子调节，以此建立一种势能储备，供细胞其他耗能过程利用［12］。泥蚶［9］在盐度4胁迫、魁蚶稚贝［8］在盐度15胁迫时同样出现4 d升高、5 d恢复的现象；青鳉（Oryzias latipes）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）［25-26］在盐度胁迫下鳃Na＋／K＋-ATP酶活力也出现相似的现象。推测水生生物盐度胁迫后可能有4 d的适应调节期，贝类鳃Na＋／K＋-ATP酶活力在4 d内无显著上调趋势时，预示着该盐度已超出贝类盐度耐受范围。

鳃Ca2＋-ATP酶与Mg2＋-ATP酶活力变化趋势与Na＋／K＋-ATP酶活力变化趋势类似。推测4 d左右时其将大量细胞质基质中Ca2＋转运到肌质网腔中储存起来，抑制肌细胞收缩［12］，这可能与贝类在受胁迫时的闭壳有关，Ca2＋-ATP酶活力的上升促进开壳正常滤水摄食。由于贝类的闭壳行为受肌肉收缩这一耗能过程控制，且贝类行为可能与水中Mg2＋浓度有关［27-28］，推测Ca2＋-ATP酶与Mg2＋-ATP酶活力的变化与闭壳之间可能存在相关性。

受到盐度胁迫时，河蚬首先闭壳应对胁迫，导致摄食率随之下降［29］。在盐度胁迫耐受范围内，通过Na＋／K＋-ATP酶活升高进行离子调节，同时激活Ca2＋-ATP酶与Mg2＋-ATP酶来解除闭壳状态，促进贝类的正常生理活动；如果超出盐度耐受范围，ATP酶活力在4 d内不会上升进行适应调节，河蚬始终处于闭壳状态，摄食率处于极低水平，最终导致死亡。因此鳃Na＋／K＋-ATP酶亦可作为双壳贝类耐盐性能的指示指标。