盐度骤变对金钱鱼幼鱼抗氧化状态的影响

孙雪娜，冯广朋，3，刘鉴毅，3，王 妤，庄 平，3，余焱方，邹 雄

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；3.农业农村部东海与长江口渔业资源环境科学观测实验站，上海 200090）

金钱鱼（Scatophagus argus）俗称金鼓鱼，隶属于鲈形目（Perciformes），金钱鱼科（Scatophagidae），金钱鱼属，主要分布于我国的东海南部、南海和北部湾地区［1］。金钱鱼既可食用又可作为观赏鱼，经济价值很高，是南方沿海池塘单养和网箱套养的重要种类［2］。金钱鱼幼鱼在盐度5～20范围内生长较快，但经驯化在盐度0～35范围内均可存活［3-4］，有望推广到低盐度的咸淡水水域和高盐度的盐碱水水域养殖，有较好的养殖前景。

盐度是影响鱼类生长、代谢及各种生理活动的重要因子［5-6］，也是影响推广养殖的重要因素之一。近年来的研究表明，环境盐度变化可能造成鱼体抗氧化防御系统受损而引起氧化应激［7-10］。氧化应激产生过多的氧自由基会攻击生物膜、蛋白质和核酸，造成细胞质外流、酶失活、遗传复制错误等氧化损伤，进而扰乱鱼类正常的生理和行为活动［11］。鱼体中的抗氧化系统可抵御氧化损伤。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）是抗氧化系统中重要的抗氧化酶，还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是非常重要的非酶促成分［12-13］。SOD是生物体内清除自由基的首要物质，通过歧化作用分解超氧阴离子自由基，SOD清除·后产生H2O2，CAT能将H2O2转化为H2O，使机体免受H2O2的毒害［14］。GSH作为一种抗氧化剂，可以参与消除有毒过氧化物［13］。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是脂质过氧化物，可以间接反映组织细胞脂质过氧化的程度［15］。以上均为研究中常用的抗氧化指标。

金钱鱼在推广养殖过程中，多会经历盐度的驯化，但目前国内外对金钱鱼急性耐盐性和抗氧化应激方面的研究较少见，因此本研究以金钱鱼幼鱼为研究对象，开展盐度骤升和骤降实验，研究不同组织在抗氧化方面应对盐度骤变时的生理应答，旨在分析盐度变化对其抗氧化状态的影响，指导盐度驯化和养殖等过程，为金钱鱼规模化养殖推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼与养殖设计

养殖实验在东海水产研究所福鼎科研基地进行，实验用鱼为东海水产研究所海南琼海实验基地人工繁育的金钱鱼幼鱼，平均体长为（4.70±0.86）cm，平均体质量为（6.27±0.28）g，暂养30 d。暂养期间水温为（22±0.5）℃，盐度20（当地自然海水盐度），24 h充气泵充氧。每天8∶00和17∶00饱食投喂“正大”牌浮性配合饲料（粗蛋白≥30%，粗脂肪≥3%，粗灰分≤14%，水分≤12%，粗纤维≤14%，总磷≥0.8%，赖氨酸≥1.43%），每3 d换水2／3，吸去底部污物并清理残饵。暂养结束后挑选健康无病的金钱鱼幼鱼进行实验。

盐度梯度设为5、20和35，以盐度20暂养海水为对照组，每个盐度梯度设置3个平行，每个平行随机放入30尾鱼。盐度35的实验用水由当地海水与海水晶配制而成，盐度5的实验用水由自然海水和淡水按比例配制而成，充分曝气并用盐度计进行校正，稳定48 h后使用。实验容器采用体积为300 L的圆塑料桶。实验开始时，随机从暂养群体中捞取个体直接放入各盐度组（含对照组）水体中。实验期间管理同暂养时一致。

1.2 取样和检测方法

从试验鱼放入各试验组水体作为起始0 h并开始计时，在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、7 d时，从各盐度梯度组中分别取样，每个平行每次取3尾鱼，置于冰盘内解剖，取其肝脏、鳃和肌肉，组织样品先用剪刀剪碎，准确称取0.2 g于玻璃匀浆管中，按质量与体积比1∶9加入生理盐水，于冰水浴下匀浆，以2500 r·min-1离心10 min后取上清，然后分别稀释至所需浓度后进行SOD、CAT酶活力和GSH、MDA含量的测定。其中，蛋白含量采用考马斯亮兰法测定，以牛血清蛋白为标准。SOD活力采用黄嘌呤氧化酶法测定，在波长为550 nm处比色测定吸光度值计算其活力，活力单位定义为：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位（U·mgprot-1）。CAT活力通过405 nm波长下测定H2O2减少的量测定，活力单位定义为：每毫克组织蛋白每秒分解1μmoL的H2O2的量为1个CAT活力单位（U·mgprot-1）。SOD、CAT酶活力和GSH、MDA含量均按照说明采用南京建成试剂盒检测。

1.3 数据处理与统计

实验数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，各组数据通过SPSS 24.0软件处理分析，利用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan's检验法进行显著性差异分析和多重比较，P＜0.05表明差异显著。

2 结果与分析

2.1 盐度骤变对幼鱼行为和成活率的影响

盐度骤变后，盐度5和35组的金钱鱼幼鱼最初表现出贴壁狂游、鳃盖煽动频率加快、摄食量减少等一些应激行为。在盐度处理7 d内，金钱鱼幼鱼的存活率为100%。

2.2 盐度骤变对幼鱼肝脏抗氧化状态的影响

由图1-A所见，SOD活力盐度5组在12 h时较初始值显著下降（P＜0.05），后于48 h升至最高，显著高于初始值（P＜0.05），48 h～7 d期间，SOD活力逐步下降并趋于稳定。SOD活力盐度35组在12 h内显著下降（P＜0.05），此后逐渐升高，7 d时显著高于其他各时间值（P＜0.05）。对于相同处理时间的不同盐度组：在6～24 h期间，低盐组和高盐组SOD活力均显著低于对照组（P＜0.05），48 h时各盐度组差异不显著，之后盐度35组SOD活力上升，7 d时，SOD活力显著高于对照组（P＜0.05）。

如图1-B，CAT活力在盐度5和35组中均呈先下降后升高的趋势，12 h时最低，显著低于12 h后的各时间点（P＜0.05）。盐度5组CAT活力12 h后逐渐升高，并趋于稳定，7 d时与初始水平一致。盐度35组CAT活力在12 h后逐渐升高，在7 d时达到最高（P＜0.05）。对于相同处理时间的不同盐度组：12 h时，低盐和高盐组CAT活力均显著低于对照组（P＜0.05）；7 d时，盐度35组酶活力显著高于对照组（P＜0.05）。

GSH含量在两处理组肝脏中均经历两次先升高后降低的变化趋势（图1-C），均于6 h达到最大值，显著高于处理前水平（P＜0.05），并分别于96 h和24 h时达到最小值，较处理前水平无显著差异（P＞0.05）。对于相同处理时间的不同盐度组：24 h时，盐度35组GSH含量显著低于对照组（P＜0.05）；除24 h外，盐度处理组与对照组间无显著差异（P＞0.05）。

如图1-D，MDA含量盐度5组肝脏中先升高后降低，最后趋于稳定，12 h时含量最高，较处理前水平差异不显著（P＞0.05）。盐度35组MDA含量于12 h时显著高于处理前（P＜0.05），随后降低再升高，7 d时，MDA含量仍显著高于处理前水平（P＜0.05）。对于相同处理时间的不同盐度组：盐度35组在12 h和96 h时，MDA含量显著高于对照组（P＜0.05）。

图1 盐度骤变对金钱鱼幼鱼肝脏抗氧化指标的影响Fig.1 Effect of abrupt salinity changes on antioxidant indexes in liver of juvenile S.argus

2.3 盐度骤变对幼鱼鳃抗氧化状态的影响

如图2-A所示，鳃中SOD活力两胁迫组变化趋势一致，均呈先升高后降低最后保持平稳的趋势。盐度5和35组SOD活力分别于12 h和24 h时最高，均显著高于处理前水平（P＜0.05），随后下降，7 d时与处理前水平一致。比较相同处理时间的不同盐度组：盐度5组在6 h、12 h、24 h和48 h时，SOD活力显著高于对照组（P＜0.05）；盐度35组在12 h、24 h时显著高于对照组（P＜0.05）。

鳃中CAT活力在盐度5和35组中均呈先升高后降低再保持平缓的趋势（图2-B）。盐度5和35组，均在12 h时出现峰值，显著高于初始水平（P＜0.05），随后逐渐降低。盐度5组CAT活力于48 h后保持平稳状态，且显著低于初始水平（P＜0.05）。盐度35处理组CAT活力于24 h后与初始水平一致。比较相同处理时间的不同盐度组：盐度5组除了在6 h和12 h时CAT活力显著高于对照组外（P＜0.05），其余时间点较对照组无显著差异（P＞0.05）；盐度35组在6 h、12 h和48 h时，CAT活力显著高于对照组（P＜0.05）。

鳃中GSH含量在盐度5和35组随时间呈先升高后降低的趋势（图2-C）。盐度35和盐度5组GSH含量先后于6 h和12 h时达到最大值，且显著高于初始值（P＜0.05）。比较相同处理时间的不同盐度组：12 h时，盐度5组GSH含量显著高于对照组（P＜0.05）；96 h时，盐度35组GSH含量显著低于对照组（P＜0.05）。

如图2-D，鳃中MDA含量两盐度处理组在12 h时达到各自组中的峰值，显著高于处理前（P＜0.05）。盐度5组，MDA含量在12 h后降低，7 d时已降至处理前水平。盐度35组，MDA含量在12 h后波动降低，但7 d时仍显著高于处理前（P＜0.05）。比较相同处理时间的不同盐度组：12 h和96 h时，盐度35组MDA含量显著高于对照组和盐度5组（P＜0.05）；7 d时各组间差异不显著（P＞0.05）。

图2 盐度骤变对金钱鱼幼鱼鳃抗氧化指标的影响Fig.2 Effect of abrupt salinity changes on antioxidant indexes in gill of juvenile S.argus

2.4 盐度骤变对幼鱼肌肉抗氧化状态的影响

肌肉SOD活力随时间的变化趋势与鳃中相似，盐度骤变后，酶活力值先升高后降低再保持平稳水平（图3-A）。盐度5和35组，SOD活力分别于6 h和12 h时，显著高于其他各时间点对应的酶活力值（P＜0.05）。对于相同处理时间的不同盐度组：6 h、12 h时，盐度5组SOD活力显著高于对照组（P＜0.05）；6 h、12 h、24 h时，盐度35组SOD活力显著高于对照组（P＜0.05），但在48 h时显著低于对照组（P＜0.05）；7 d时各盐度组间无显著差异（P＞0.05）。

如图3-B，肌肉中CAT活力盐度5组在7 d内各时间段均无显著性差异（P＞0.05）。盐度35组中CAT活力6 h和12 h时显著低于其余各值（P＜0.05），12 h后CAT活力波动上升至初始水平。对于相同处理时间的不同盐度组：仅在6 h和12 h时，盐度35处理组CAT活力显著低于对照组（P＜0.05）；其余时间点各盐度组间无显著差异（P＞0.05）。

随着处理时间的延长，肌肉中GSH含量在盐度5组中先平缓上升后平缓下降（图3-C），12 h时最高，显著高于处理前（P＜0.05），96 h和7 d时显著低于处理前（P＜0.05）。盐度35组在12～24 h期间升至最高，之后逐渐下降至处理前水平。相同处理时间的不同盐度组均无显著差异（P＞0.05）。

肌肉中MDA含量在盐度5和35组中，经波动起伏后均恢复至处理前水平（图3-D），同一盐度条件下各时间段的MDA含量均无显著差异（P＞0.05）。相同处理时间下的不同盐度组间均无显著性差异（P＞0.05）。

图3 盐度骤变对金钱鱼幼鱼肌肉抗氧化指标的影响Fig.3 Effect of abrupt salinity changes on antioxidant indexes in muscle of juvenile S.argus

3 讨论

3.1 盐度骤变对幼鱼行为和成活率的影响

金钱鱼属广盐性鱼类，可在海水、淡咸水中生长发育，甚至经驯化后能在淡水中生存［16-17］。本研究表明，盐度突然升高或降低对金钱鱼幼鱼行为和成活的影响较小，盐度骤变7 d内无死亡情况，说明金钱鱼幼鱼对于急性盐度变化有较强的适应性，有利于盐度驯化。

3.2 盐度骤变对幼鱼肝脏抗氧化状态的影响

肝脏是机体对外界刺激反应最早、最敏感的器官之一，也是进行氧化反应较多的器官［18-19］。与花鲈（Lateolabrax maculatus）［15］、点带石斑鱼（Epinephelus malabaricus）［20］和点篮子鱼（Siganus guttatus）［5］等众多鱼类中的研究结果一致，本研究中，金钱鱼幼鱼肝脏中抗氧化酶活力和GSH含量最高，肝脏是金钱鱼抗氧化防御的主要器官。

本研究中，盐度骤升和骤降后，金钱鱼幼鱼肝脏中的SOD和CAT活力先降低，随时间延长酶活力恢复，然后逐渐升高，这与云纹石斑鱼（Epinehelus moara）［21］、暗 纹 东 方 鲀（Takifugu obscurus）［22］和 海 洋 青 鳉 鱼（Oryzias melastigma）［23］中的研究结果一致。出现该现象的原因可能是盐度15的波动幅度引起肝脏强烈的应激反应，抑制了SOD和CAT活性，随后活力升高以清除过多的活性氧自由基。GSH含量在以上两种抗氧化酶活力降低的同时补偿性增长以清除机体内多余的活性氧自由基，虽在7 d时恢复至对照组水平，但期间波动起伏较多，可能是GSH与多种抗氧化酶进行反应的结果［24］。在SOD和CAT活力较低时MDA含量较高，可能是由于抗氧化酶活性受到抑制，MDA含量累积，随着酶活力升高，MDA含量有所降低。7 d时，盐度骤降组肝脏中SOD、CAT、GSH与MDA水平均与对照组一致，说明此时抗氧化系统已经适应了盐度降低的变化。在革胡子鲇（Claries lazera）［25］的研究中发现，随盐度骤变时间的延长，肝脏中SOD、CAT活力和MDA含量有逐渐升高的趋势。与该结果相似，在本研究的高盐组中，7 d时SOD和CAT活力与MDA含量仍保持较高水平，这可能是因为金钱鱼幼鱼肝脏对盐度骤升产生的氧化应激压力大，适应过程较长。

3.3 盐度骤变对幼鱼鳃抗氧化状态的影响

鳃是鱼类渗透压调节的关键器官，对离子的调节具有重要作用［5］。在盐度发生变化时，鳃不仅要及时进行渗透调节，还承受了一定的氧化应激压力。胡静等［26］研究发现，随着盐度的降低，鳃丝的CAT活性在最初阶段呈上升趋势，前48 h内CAT活性较强，96 h时基本恢复至对照组水平。GHANAVATINASAB等［27］发现，将黄鳍棘鲷（Acanthopagrus sheim）由盐度20转入盐度5、12和34的环境中，14 d后，鳃中CAT、SOD、GPx和MDA水平在各组间均无显著性差异。本研究结果与以上结果相似，当盐度骤升和骤降时，金钱鱼幼鱼鳃中SOD、CAT和GSH为清除自由基，出现了水平先升高后降低的趋势，最终7 d时又恢复至与对照组相似的水平。盐度5组鳃MDA含量经历了一定程度的先升高，后下降至对照组水平，说明盐度降低条件下，金钱鱼幼鱼鳃组织可以抵御氧化应激，较快地恢复正常。本研究发现，鳃组织应对盐度骤变产生的氧化应激时表现与肝脏不同，推测不同组织受氧化应激程度不同，抵御策略也存在差异。

3.4 盐度骤变对幼鱼肌肉抗氧化状态的影响

肌肉在鱼体中分布广、比重大，对其进行抗氧化酶活性的测定也可以反映出鱼体对环境的抗氧 化 应 激 情 况［28］。赵 峰 等［29］在 施 氏 鲟（Acipenser schrenckii）的研究中认为，肌肉属于渗透压感知的敏感组织，在盐度发生变化时能够积极响应。在军曹鱼（Rachycentron canadum）［28］中，肌肉SOD和CAT活力均随着盐度的降低而增高。与以上研究结果不完全相同的是，盐度突然升高和降低后，金钱鱼幼鱼肌肉SOD活力先升高后降低再趋于平稳。CAT活力在盐度骤降后先升高后降低，最后保持与对照组一致的平稳水平；在盐度骤升后则先降低后上升，最终恢复至对照组水平。盐度骤变条件下，SOD和CAT活力变化不一致的现象在点带石斑鱼［19］、黄姑鱼（Nibea albiflora）［30］和 银 鲳（Pampus argenteus）［31-32］肝脏中都观察到类似情况，但目前有关盐度骤变处理对鱼类肌肉抗氧化酶影响的报道并不多，出现该现象的原因还需进一步探讨。盐度骤变对金钱鱼幼鱼肌肉中GSH和MDA含量影响不大，推测是因为肌肉中产生的氧化应激较小。

4 小结

金钱鱼幼鱼在急性盐度胁迫下有较强的适应性，在盐度20条件下，突然升高或降低15的盐度梯度，存活率几乎不受影响。盐度骤变7 d后，肝脏、鳃和肌肉中的抗氧化状态接近或恢复至处理前水平，适合驯养。与盐度骤升相比，金钱鱼幼鱼在盐度骤降时面临的氧化压力较小，恢复时间较快。本研究结果为金钱鱼幼鱼养殖过程中的盐度驯化提供了一定指导，可供金钱鱼的规模化养殖发展参考。