携带DEV-gB基因重组质粒减毒沙门氏菌在鸭免疫器官中的表达动态

刘妍罕 王相金 胡安东 曾茂芹 杨颖 温贵兰 程振涛 文明

摘 要：为明确含DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌在鸭免疫器官中的分布动态，本研究将重组减毒沙门氏菌口服接种鸭（即重组细菌组），同时设立重组质粒组、弱毒疫苗组和空白对照组，于免疫后第7、14、21、28、35、42和49天时，捕杀试验鸭，采集鸭脾脏、胸腺、法氏囊和哈德氏腺等免疫器官，采用间接免疫荧光法进行DEV-gB抗原检测观察，结果显示：空白对照组鸭免疫器官在7个时间点均未检测到DEV-gB抗原信号;免疫后，重组细菌组、弱毒疫苗组和重组质粒组鸭免疫器官均能检测到DEV抗原阳性信号，但含DEV抗原阳性信号细胞数量从多到少的组别顺序是弱毒疫苗组、重组细菌组和重组质粒组，且重组细菌组与弱毒疫苗组差异不显著（P>0.05）;检出含DEV抗原阳性信号的免疫器官先后顺序是脾脏、法氏囊、哈德氏腺和胸腺，而含DEV抗原阳性信号细胞数量从多到少的免疫器官顺序是脾脏、法氏囊、胸腺和哈德氏腺。由此可见，本研究构建的携带DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌能在鸭免疫器官中得到良好的表达，为该重组细菌疫苗的临床应用奠定了理论基础。

关键词：DEV;重组减毒沙门氏菌;鸭;表达动态

中图分类号：S8

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2021）06-0037-07

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.06.005

Abstract：To determine the distribution dynamics of recombinant attenuated salmonella carring DEV-gB gen in the immune organs of ducks，and inoculated with recombinant bacteria，recombinant plamid，attenuated vaccine and sterile PBS silution （blank control），respectively.The experimental ducks were killed at the 7th，14th，21th，28th，35th，42th and 49th day after immunization，and the spleen，thymus，Fabricius bursa and Hardy's gland were collected，and detected for DEV-gB antigen by indirect immunofluorescence method.The results showed that no signal of DEV-gB antigen was detected in duck immune organs of blank control group at every time-point，but positive signal presented in the other three groups.And the cell number with DEV-gB positive signal in the recombinant bacteria group was ，the most，followed by attenuated vaccine group and recombinant plasmid group，but there was no significant difference between the recombinant bacteria group and the attenuated vaccine group.The order of the immune organs detected with positive signal of DEV-gB antigen were respectively spleen，Fabricius bursa，Hardy's gland and thymus，while the cell number with DEV-gB positive signal in spleen were the most，followed by Fabricius bursa，thymus and Hardy's gland.Therefore，the recombinant attenuated Salmonella  carrying DEV-gB gene could be well expressed in duck immune organs，laying a theoretical basis for the clinical application of the recombinant bacterial vaccine.

Keywords：DEV;recombinant attenuated Salmonella;duck;expression dynamics

鴨病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE）亦称鸭瘟（Duck plague），是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起鸭、鹅和多种雁形目禽类发生一种以血管损伤、体腔溢血、消化道出血性坏死和淋巴器官受损为特征的急性、热性、败血性传染病[1]。DVE流行广泛，传播迅速，具有较高的发病率和死亡率，常给养鸭产业造成巨大的经济损失。目前，该病主要以疫苗接种预防为主，且多采用肌肉或皮下接种，极不方便。因此，研发新型疫苗，寻求简便的接种途径，是鸭病毒性肠炎防控的重要方向之一[2]。通过基因工程减毒的沙门氏菌能携带外源基因，可通过饮水等途径，将外源基因直接携入动物细胞内表达相应的蛋白，诱导产生良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答效果，特别适用于规模化养殖的群体免疫[3]。

DEV属于疱疹病毒科，基因组大小约为150 kb，可编码多种结构蛋白，其中编码的gB蛋白是一种囊膜糖蛋白，为病毒感染和复制所必需，具有良好的免疫原性。本实验室前期成功构建了DEV-gB基因重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB，并转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207，得到基于DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌疫苗[4-5]。本研究在此基础上，将该重组疫苗免疫注射鸭，采用免疫组化法分析其在鸭免疫器官中的表达动态，以期为该重组疫苗的免疫效果评价和临床示范应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 重组质粒、重组减毒沙门氏菌、鸭瘟疫苗及试验用鸭

重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB和含重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207，由贵州省动物生物制品工程技术研究中心构建并保存。鸭病毒性肠炎弱毒疫苗，购于辽宁益康生物制品有限公司。试验用鸭为1日龄四川内江白鸭160只，购自四川省内江市某种鸭场，经血清学和病原学检测为DEV抗体和核酸阴性。

1.2 主要检测试剂和仪器

核酸提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司;粘片剂多聚赖氨酸，购自武汉博士德生物工程公司;伊文思蓝，购自Sigma公司;兔抗DEV-gB-IgG和FITC-羊抗兔IgG等，购自北京中杉金桥生物技术有限公司;石蜡切片机（KH-Q2016），湖北阔海医疗科技有限公司;荧光显微镜（BFM-330），上海比目仪器有限公司。

1.3 试验分组与免疫动物

试验鸭饲养7 d观察无异常，随机分为4组即重组质粒组、重组细菌组、弱毒疫苗组和空白对照组，每组40只。免疫前禁水禁食4 h，重组细菌组口服接种含重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB减毒鼠伤寒沙门氏菌，108 CFU/只;重组质粒组肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB，200 μg/只;弱毒疫苗组皮下注射弱毒疫苗，0.5 mL/只;空白对照组肌肉注射灭菌PBS缓冲液，0.5 mL/只。至鸭21日龄时再如上方法加强免疫1次。

1.4 样本采集与处理

于第1次免疫后第7、14、21、28、35、42和49天，每组随机挑取试验鸭3只，颈静脉采血致死，剖解无菌采集鸭脾脏、胸腺、法氏囊和哈德氏腺，于4%多聚甲醛溶液固定一定时间后，适当修块，自来水漂洗30 min，于系列梯度乙醇中脱水后，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机切片，取蜡片置于多聚赖氨酸处理号的载玻片上展平，60 ℃烤箱烘烤2 h，备用。

1.5 间接荧光法检测DEV-gB抗原表达动态

取上述含蜡片的载玻片，常规甲苯脱蜡和低渗复水后，柠檬酸缓冲液修复抗原，以3% H2O2-甲醇封闭组织内源性过氧化物酶和非免山羊血清封闭非特异性抗原位点后，加入兔抗DEV-gB-IgG孵育过夜，PBS-T洗绦3次;加入FITC-羊抗兔IgG，37 ℃避光作用1 h，PBS-T洗涤3次，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，SPOT-ADVANCE软件拍照。

1.6 结果判定与数据统计

于光学显微镜下观察，根据有无黄绿色荧光及其细胞数量进行判定：若视野下无黄绿色荧光，判为阴性（-）;黄绿色荧光细胞数量少于5%，判为弱阳性（+）;黄绿色荧光细胞数量为5%～50%，判为阳性（++）;黄绿色荧光细胞数量大于50%，判为强阳性（+++）。同一时间段每份组织观察3个视野，统计和计算呈现黄绿色荧光的细胞数量，结果用GraphPad软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 空白对照组DEV-gB抗原在鸭免疫器官中的表达动态

经观察，空白对照组鸭在第7、14、21、28、35、42和49天时，其脾脏、胸腺、法氏囊和哈德氏腺均未呈现黄绿色荧光为阴性。

2.2 试验组DEV-gB抗原在鸭脾脏中的表达动态

经观察，重组细菌组鸭免疫后第7天时，脾脏可见黄绿色荧光为弱阳性信号（图1-a），至第35天时，脾脏呈强阳性信号（图1-b），之后均呈强阳性信号。重组质粒组鸭免疫后第7天时，脾脏亦呈现弱阳性信号（图1-c），至第21天时，脾脏呈现强阳性信号（图1-d），之后均呈强阳性信号。弱毒疫苗组鸭免疫后第7天时，脾脏呈现黄绿色荧光为弱阳性信号（图1-e），至第28天时，脾脏呈现强阳性信号（图1-f），之后均呈强阳性信号。

2.3 试验组DEV-gB抗原在鸭胸腺中的表达动态

经观察，重组细菌组鸭免疫后21 d时，其胸腺呈现黄绿色荧光为弱阳性（图2-a），至42 d时其阳性信号最强（图2-b），之后阳性信号呈现下降趋势。重组质粒组鸭免疫后28 d，其胸腺可見黄绿色荧光为弱阳性（图2-c），至42 d时呈强阳性信号（图2-d），之后均呈强阳性信号。弱毒疫苗组鸭免疫后21 d，其胸腺可见黄绿色荧光为弱阳性（图2-e），至42 d时其阳性信号最强（图2-f），之后阳性信号呈现下降趋势。

2.4 试验组DEV-gB抗原在鸭法氏囊中的表达动态

经观察，重组细菌组鸭免疫后7 d，其法氏囊可见黄绿色荧光为弱阳性（图3-a）;至21 d时其阳性信号最强（图3-b），之后阳性信号呈下降趋势。重组质粒组鸭免疫后14  d，其法氏囊呈弱阳性信号（图3-c），至35 d时其阳性信号最强（图3-d），之后阳性信号呈下降趋势。弱毒疫苗组鸭免疫后7 d时，其法氏囊呈弱阳性信号（图3-e），至28 d时其阳性信号最强（图3-f），之后阳性信号呈下降趋势。

2.5 试验组DEV-gB抗原在鸭哈德氏腺中的表达动态

经观察，重组细菌组鸭免疫后7 d，其哈德氏腺可见黄绿色荧光为弱阳性（图4-a），至35 d时其阳性信号最强（图4-b），之后阳性信号呈下降趋势。重组质粒组鸭免疫后21 d，其哈德氏腺呈若阳性信号（图4-c），至第35天时其阳性信号最强（图4-d），之后阳性信号呈下降趋势。弱毒疫苗组鸭免疫后14 d，其哈德氏腺可见弱阳性信号（图4-e），至28 d时其阳性信号最强（图4-f），之后阳性信号呈下降趋势。

2.6 试验组鸭免疫器官含DEV-gB抗原信号细胞数量统计结果

采用间接免疫荧光法处理，荧光显微镜观察，对含DEV-gB抗原信号的细胞数量进行计数，同一组织同一时间观察计数3张切片，每张切片3个视野后求平均值，结果如表1所示：免疫后鸭免疫器官均可检测到DEV-gB抗原信号，其中：重组细菌组鸭免疫器官含阳性信号细胞数量与弱毒疫苗组差异不显著（P>0.05），显著高于重组质粒组（P<0.05）。

3 结论与讨论

DEV能够在鸭群中广泛传播，感染力强、速度快，鸭或其他水禽体内可以持续存在，死亡率较高，给养鸭户造成一定的经济损失。鸭瘟疫苗多采用肌肉或皮下接种，李爱欣等[6]通过临床证实鸭瘟活疫苗可以诱导鸭呼吸道和消化道局部黏膜产生DEV特异性抗体，滴鼻免疫可以诱导鸭产生与肌注接近同等的保护力，为本试验研发新型疫苗提供接种新途径。

本研究构建的携带DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌能在鸭免疫器官中得到良好的表达。研究结果显示，通过间接荧光法检测DEV-gB抗原在鸭免疫器官中的表达动态，在鸭脾脏、胸腺、哈德氏腺和法氏囊中，重组细菌组、弱毒疫苗组和重组质粒组都检测出阳性。免疫器官的三个组别中，脾脏的阳性信号细胞数量最多，说明DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌疫苗能够在脾脏中高效表达。目前报道了携带不同基因的减毒沙门氏菌在动物体内比较稳定，重组细菌免疫产生抗体与对照组相比差异显著（P<0.05），与本试验免疫结果相似。重组细菌组与弱毒疫苗组从抗原细胞数量上比较差异不显著，重组细菌组鸭免疫器官含阳性信号细胞数量接近弱毒疫苗组（P>0.05），明显高于重组质粒组（P<0.05），表明DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌疫苗与市场成熟的DEV弱毒疫苗效果相当，可以进行临床应用[11-12]。重组质粒组鸭免疫器官均能检测到DEV抗原阳性信号，说明该疫苗能将重组质粒带至免疫器官并释放重组质粒，使目的基因的转录和表达顺利进行。新型基因编辑已运用在疫苗开发中[7-10]，但在应用过程中仍存在脱靶效应高等障碍，所以利用免疫组化法分析其在免疫器官中的表达动态是很有必要的，可以为疫苗的靶向研究提供理论基础。DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌疫苗能够在免疫器官中表达，是否也能改变和调节宿主免疫的功能是值得研究的科学问题。

本研究结果表明，携带DEV-gB基因重组减毒沙门氏菌能在鸭免疫器官中得到良好的表达，并且与弱毒疫苗在表达效果上差异不显著，外源基因能够直接携入动物细胞内，为研发口服疫苗，获得免疫评价效果和临床示范应用打下良好的理论基础[13-15]。

参 考 文 献：

[1] 肖瑞琪，汪铭书.鸭瘟诊断方法研究进展[J].动物医学进展，2019，40（9）：84-88.

[2] 傅光华，陈翠腾，刘荣昌，等.鸭瘟病毒新近分离毒株部分基因变异分析[J].畜牧兽医学报，2018，49（10）：2215-2222.

[3] 田彬，汪铭书，程安春.鸭瘟病毒致病性研究进展[J].中国家禽，2018，40（12）：38-42.

[4] 田琴，张明华，周碧君，等.鸭瘟病毒感染鸭十二指肠黏膜炎症相关基因及调控通路的筛选[J].中国畜牧兽医，2020，47（10）：3323-3333.

[5] 杨霞，蒲翠敏，胡安东，等.鸭肠炎病毒感染对鸭肠道菌群多样性的影响[J].中国预防兽医学报，2020，42（8）：772-778.

[6] 李爱欣，李颖异，蒋文燦，等.鸭瘟活疫苗滴鼻诱导的黏膜免疫效果评价[J].中国预防兽医学报，2018，40（12）：1157-1162.

[7] 刘成，司振书，郭晶，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在禽病毒病研究中的应用[J/OL].中国预防兽医学报，2021：1-6.

[8] 林霞琳，黄春芳，陈育琪，等.靶向DEC-205的弓形虫SAG1 DNA疫苗的构建及鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2020（20）：72-75，80，159.

[9] LI Y A，CHEN Y，DU Y Z，et al.Live-attenuated salmonella enterica serotype choleraesuis vaccine with regulated delayed fur mutation confer protection against streptococcus suis in mice[J].BMC Veterinary Research，2020，16（1）：129-112.

[10] APINDA N，NAMBOOPPHA B，RITTIPOMLERTRK A，et al.Protection against fowl cholera in ducks immunized with a combination vaccine containing live attenuated duck enteritis virus and recombinant outer membrane protein H of Pasteurella multocida[J].Avian Pathol，2020，49（3）：221-229.

[11] 陈柳，倪征，余斌，等.重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子[J].中国农业科学，2020，53（24）：5125-5134.

[12] 陈月香.鸭瘟病例的诊断与紧急免疫疫苗的效果观察[J].中国兽医杂志，2018，54（12）：48-49.

[13] 万春和，刘荣昌，陈翠腾，等.鸭肠炎病毒强毒和疫苗弱毒鉴别诊断PCR方法的建立[J].福建农业学报，2018，33（3）：219-224.

[14] 刘月焕.加快推进我国水禽疫病防控技术的研究[J].中国农业科学，2019，52（23）：4386-4389.

[15] 马云潮，程安春，汪铭书，等.重组鸭肠炎病毒载体疫苗研究进展[J].畜牧兽医学报，2017，48（11）：2015-2022.