氨基纳米纤维素的制备及其抗菌应用研究进展

于亚童 王晓映 王文波 赵 鑫 孔凡功 王守娟

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东济南，250353）

纤维素是由β-D-吡喃式葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性高分子化合物，主要来源有木材、竹材、农作物秸秆、海藻、细菌和真菌等[1]，是一种天然可再生资源，具有良好的生物相容性和可降解性。纤维素分子链上的活性羟基可以发生氧化[2]、醚化[3]、酯化[4]和接枝共聚[5]等反应，从而使纤维素分子链上具有羧基、氨基和羰基等官能团，为纤维素增添新的功能，如氨基化纤维素可以用于细菌的捕获和CO2及金属离子的吸附[6]。纳米纤维素是指直径在1～100 nm的纤维材料[7-9]，其既保留了天然纤维素的良好性能，且比表面积大、透明度高、强度大、密度低[10]，不仅可以作为吸附抗菌材料，还可以作为药物载体、组织替代材料等用于生物医药领域。

氨基化纳米纤维素，又称胺化纳米纤维素，是通过将含有氨基的化合物交联到纳米纤维素表面得到的功能化纤维[11]。由于氨基带有正电荷，所以氨基改性后的纳米纤维素分子表面大都显正电；同时，氨基可以增强纤维素与金属离子的络合能力，这都有利于增强纳米纤维素与细菌的结合力，为氨基化纳米纤维素在抗菌材料中的应用提供可能。本文首先介绍纳米纤维素常用的制备方法和纳米纤维素氨基化改性的研究进展；最后对氨基化纳米纤维素的抗菌机理和在抗菌材料中的应用进行综述。

1 纳米纤维素的制备

纳米纤维素是以天然纤维为原料，经物理或化学等手段处理得到的直径在1～100 nm的纤维材料。图1所示为以木质纤维素为原料制备纳米纤维素的简单流程[12]，木材粉碎后利用化学试剂（氯水或硝酸乙醇等）去除半纤维素和木素，得到纤维素，在分子间氢键的作用下，纤维素分子缠绕成微米级的结构；然后经化学、物理或生物手段处理，破坏分子间氢键作用，得到分散程度更高的纳米纤维素。依据获得纤维的长度和结晶度等性能的不同，将木质纳米纤维素分为纤维素纳米纤丝（CNF）和纤维素纳米晶体（CNC），具体特征见表1。CNF的结晶度低于CNC，可用于负载粉状纳米材料[13]，CNC则具有更好的刚性，可用作增强填料[14]。

表1 不同类型纳米纤维素的特征Table 1 Characteristics of different types of nanocellulose

图1 纳米纤维素生产工艺流程[12]Fig.1 Production process of nanocellulose[12]

细菌纤维素（BC）主要由醋酸杆菌、土壤杆菌、肠杆菌、固氮菌和根瘤菌等微生物合成[15-16]，BC的分子链长度明显高于木质纤维素，且合成时具有很高的纯度和结晶度，常用于生物医用材料，如伤口敷料[17]等。

纳米纤维素的制备方法主要分为机械法、化学法、生物法以及化学/生物预处理结合机械法，很多人已经对纳米纤维素的制备方法进行了综述[10,21-22]。机械法大致分为高压均质法、研磨法、高强度超声法和静电纺丝法等，主要借助机械剪切力破坏分子间的氢键作用，使纤维素分子更好地分散。常用的化学法包括氧化法和酸水解法等；其中，TEMPO（2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物自由基）氧化法在TEMPO/Na⁃Cl/NaBr共氧化剂体系下，将纤维素大分子链上的伯羟基氧化为羧基，达到降低分子间氢键作用的目的，是最常用的氧化处理方法。酸水解法借助无机酸对纤维素分子链的破坏作用，将纤维素分子的无定形区部分或全部去除，通过断裂糖苷键降低聚合度，进而使纤维机械强度降低；常用的试剂包括盐酸、硫酸、磷酸和氢溴酸等。生物法利用生物处理来降低纤维素分子间氢键作用，最常用的方法是酶水解法，一般选用内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶等纤维素酶作为处理试剂。图2为纳米纤维素常见的制备方法。

不同制备纳米纤维素的方法优缺点如表2所示，为了提高纳米纤维素的制备效率，降低制备过程中所需的能耗，通常将2种方法结合使用。例如，首先利用TEMPO氧化或溶剂处理等方法降低分子间氢键作用，然后利用机械法分散纤维素，制备得到纳米纤维素，该工艺流程不仅减少了化学处理过程中各种试剂对环境的污染，而且降低了单纯机械法制备纳米纤维素过程中所需能耗。

表2 不同纳米纤维素制备方法的对比Table 2 Comparison of different preparation methods of nanocellulose

纳米纤维素制备工艺简单，原料来源丰富，生产成本低廉，且具有良好的生物相容性和可降解性，作为工业原料替代传统材料，可以降低生产成本和环境污染。例如用纳米纤维素材料替代聚乙烯等作为包装材料。此外，纳米纤维素在废水处理[30-31]、电子工业[32-34]、传感器[35-37]和食品工业[38-39]等领域也有非常广泛的应用。近年来，纳米纤维素在生物医学领域的应用引起了广泛关注，主要应用包括伤口敷料、组织再生材料及药物载体等[40-43]。作为一种环保可再生资源，纳米纤维素在各领域有广阔的发展前景，但完全替代传统材料尚有不足，如纳米纤维素脱水后的角质化问题、纳米纤维素的二次聚集、高浓度纳米纤维素不易制备、纳米纤维素材料衍生物的延展性差等问题还有待解决。

2 不同类型纳米纤维素的氨基化

利用酯化、醚化、酰胺化等反应可以将分子中含有氨基的化合物接枝到纳米纤维素表面，使纳米纤维素表面带有正电荷，从而吸附细菌等。本文首先介绍CNF、CNC和BC 3种纳米纤维素的氨基化改性方法，然后简要介绍氨基化纳米纤维素作为抗菌材料的应用。

2.1 CNF的氨基化改性

以天然纤维素为原料，经机械法、化学机械法、酶机械法等方法制备的CNF表面含有活性羟基或羧基，通过接枝反应将含有氨基的化合物接枝到CNF表面，实现CNF的氨基化改性，其中最常用的接枝反应是硅烷化反应。刘双等人[44]以桉木浆为原料，采用化学机械法制备CNF，然后以3-(2-氨基乙氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷（AEAPMDS）为改性剂，经悬浮滴定、叔丁醇置换和冷冻干燥处理得到氨基化CNF气凝胶，制备流程如图3所示。Gebald等人[45-46]以山毛榉浆为原料，利用机械法制备CNF，并分别以3-氨基丙基甲基二乙氧基硅烷（APDES）和AEAPMDS为改性剂进行CNF氨基化改性，最后利用冷冻干燥处理得到氨基化CNF。Gebald等人[47]以山毛榉木浆纤维悬浮液为原料，利用机械法制备CNF，然后以AEAP⁃MDS为改性剂制备氨基化CNF。Wu等人[48]以CNF为原料，以N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷（APS）为改性剂，完成了CNF的氨基化改性。

图3 氨基化CNF合成示意图[44]Fig.3 Schematic diagram of aminated CNF synthesis[44]

此外，醚化反应和酰胺化反应也是常用的CNF氨基化手段。He等人[49]以工业漂白硫酸盐针叶木浆为原料，利用高压剪切均质法制备CNF，并将CNF与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵在碱性环境下反应，经冷冻干燥后得到季铵功能化CNF气凝胶。Maatar等人[50]以桉木浆为原料，经TEMPO氧化、高压均质和冷冻干燥处理得到直径10～40 nm的CNF，然后将十六烷基胺接枝到CNF表面，实现CNF的氨基化改性。Zhao等人[51]以毛竹浆为原料，以乙二胺为氨基化试剂，经机械处理、酰胺化改性和冷冻干燥得到氨基化CNF气凝胶。

2.2 CNC的氨基化改性

以纤维素为原料进行CNC的生产过程必然包含去除纤维素无定形区域的处理，最常用的方法是硫酸水解法，盐酸和磷酸水解法也是经常使用的。虽然硫酸和磷酸水解法可能会在纤维表面引入少量的磺酸和磷酸基团，但由于数量有限，对后续反应没有明显影响，在CNC后续氨基化反应过程中，常用的反应基团主要是活性羟基。

常用的与纤维表面羟基进行的接枝反应是硅烷化反应。Wang等人[52]以微晶纤维素为原料，将硫酸水解法和超声处理相结合，制备出平均直径（25.4±5）nm的CNC，然后以AEAPMDS为改性剂，经冷冻干燥或超临界CO2干燥处理得到氨基化CNC气凝胶。Zhu等人[53]利用硫酸水解法将微晶纤维素制备成CNC，然后以APS为改性剂，经化学气相沉积法制备出孔径约为12 nm的氨基化CNC气凝胶。Zhang等人[54]以微晶纤维素为原料，利用硫酸水解和超声处理制备CNC，经悬浮滴定、叔丁醇置换和冷冻干燥等处理得到CNC气凝胶，然后用AEAPMDS对CNC气凝胶进行氨基化改性得到氨基化CNC气凝胶。Khanjanzadeh等人[55]以CNC悬浮液为原料，以3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）为改性剂，制备了氨基化CNC水凝胶。

此外，部分研究还在纤维表面引入羧基，利用酯化反应进行CNC的氨基化。Jin等人[56]以漂白硫酸盐杨木浆为原料，经硫酸水解、高碘酸钠氧化和超声处理得到直径3～8 nm的CNC，然后通过还原胺化处理接枝乙二胺后得到带有游离伯氨基的CNC，图4为CNC的氨基化反应过程。同时，腙化反应也是实现CNC氨基化改性的一种方法，Du等人[57]以针叶木亚硫酸盐浆为原料，将硫酸水解和超声处理相结合，制备了长度（84±23）nm、直径（4.9±0.6）nm的针状CNC悬浮液，然后加入醋酸钙、硼酸盐和水合肼，利用腙化反应实现CNC的氨基化改性。

图4 CNC的高碘酸钠氧化还原胺化反应示意图[56]Fig.4 Schematic diagram of sodium periodate REDOX amination reaction of CNC[56]

2.3 BC的氨基化改性

与木质纤维素不同，BC在菌膜中通常保持纳米级别的直径，但由于分子间的氢键作用，且BC分子质量相对较大，因此BC一般是网状结构存在。氨基化过程能有效地降低BC分子间氢键作用，实现BC的均匀分散。常用的实现氨基在BC表面接枝的反应包括酯化反应、环氧氯丙烷改性等。Huang等人[58]以木醋杆菌培养物中获得的直径在10～50 nm的BC为原料，用活性炭（AC）、乙二胺和负载四氧化三铁的二氧化硅（Si@Fe3O4）进行改性，经磁性共沉淀法制备磁性二氧化硅纳米颗粒（MS），与BC、AC混合制备了BC/AC磁性复合材料（MBCAC），最后用乙二胺进行氨基化改性，制备了一种新型的纳米结构氨基功能化磁性细菌纤维素/活性炭（AMBCAC）复合生物吸附剂，如图5所示。Shen等人[59]以木醋杆菌培养物中获取的BC为原料，利用环氧氯丙烷和二乙烯三胺对BC改性，制备氨基化BC。Klemm等人[60]利用木醋杆菌和葡萄糖合成BC，并在培养过程中将其直接设计为管状BC（BASYC®），用作人造血管插入物。Bari等人[61]以木葡糖杆菌中提取的BC为原料，利用环氧氯丙烷将金属硫蛋白接枝到BC表面，实现BC的氨基化改性。Yang等人[62]以汉氏葡糖杆菌中提取的BC为原料，以聚间苯二胺（PmPD）为改性剂，制备出直径为数十到数百纳米的BC/PmPD纳米复合材料。Ab⁃dali等人[63]利用氨基化石墨烯（AMG）与BC进行一步酯化反应，合成交联BC-氨基石墨烯/聚苯胺（CLBCAMG/PANI）纳米复合材料。Cheng等人[64]以BC膜（BCM）为原料，以三乙氧基硅烷为交联剂，将乙二胺四乙酸接枝到BCM上，实现BC的氨基化改性。

图5 AMBCAC的制备及对Pb2+和甲基橙（MO）的吸附原理图[58]Fig.5 Preparation of AMBCAC and its adsorption schematic diagram for Pb2+and methyl orange(MO)[58]

3 氨基化纳米纤维素的抗菌性能

纳米纤维素本身带有负电荷，不能实现细菌的附着，也不具有抗菌能力，将具有抗菌能力的物质（如银离子等）与纳米纤维素结合，形成的新材料用作抗菌材料，在细菌生长过程中由于环境的改变将具有抗菌能力的物质逐步释放，达到抑制细菌生长的目的。本文所提及的氨基化纳米纤维素是通过共价键作用将含有氨基的化合物接枝到纤维素表面，因在细菌生长的过程中无法释放具有抗菌能力的物质，但氨基化纳米纤维素表面带有正电荷，可以与带负电荷的细菌吸附，这为氨基化纳米纤维素的抗菌提供了可能。

氨基化纳米纤维素的抗菌机理尚不明确，常见的抗菌假说大致分为以下几种。氨基化纳米纤维素表面带有正电荷，可以促进纳米纤维素与细菌表面多种带有负电荷的磷脂（如甘油磷酸酯、心磷脂、磷脂酰丝氨酸等）作用，破坏细菌的完整性，达到抑菌的目的；研究表明，带有正电荷的粒子抗菌能力与所带的电荷量成正相关。同时，氨基是一种强络合能力的基团，氨基与细菌外膜中的Ca2+或Mg2+作用，会破坏细胞膜的稳定性，使膜的透过性增加，从而达到抑菌的效果，带正电荷的粒子与细菌表面接触，会扰乱细胞膜的透过性能。此外，氨基化纤维素通过吸附作用达到抑菌的效果，这一作用能在一定程度上抑制细菌耐药性的产生。纤维素来源广泛，价格低廉，将改性纤维素作为抗菌材料用于医疗和食品材料，能有效降低成本。

通常利用硅烷化反应将含有氨基的化合物接枝到纤维素表面，利用氨基所带正电荷吸附细菌，通过破坏细菌外膜离子平衡达到抑菌效果，且材料表现无毒或低毒性，在生物医药和食品包装等领域有良好的应用。Shao等人[65]利用APTES改性BC得到的材料能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌增殖，且不影响HEK293细胞的正常生长。Guillaume等人[66]以BC为原料，分别以APS和AEAPS为改性剂在水相中实现了BC的氨基化改性，改性后的纤维材料能有效抑制金黄色葡萄球菌的增殖。Saini等人[67]以CNF悬浮液为原料，以APS为改性剂，通过接枝反应合成了一种非浸出抗菌表面，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有良好的抑制效果。Fer⁃nandes等人[68]以BC为原料，利用APS为改性剂制备的氨基化BC能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌增殖，且对人体细胞无毒。Jean等人[69]以CNF为原料，氨己基氨丙基三甲氧基硅烷为改性剂制备的材料兼具抗菌和低毒性的特点，是一种良好创伤愈合材料。

此外，研究者还利用酰胺化反应和原子转移自由基聚合反应（ATRP）将含有氨基的化合物接枝到纤维表面，对纤维素进行氨基化改性，可实现水凝胶等抗菌材料的制备，通过破坏磷脂膜的结构达到抑菌的目的。Fourmann等人[70]利用TEMPO氧化法制备了CNF，然后将CNF与CNC、N-异丙基丙烯酰胺等材料复合成一种可用于3D打印的材料，然后在N,N-二甲基甲酰胺体系中利用N,N’-二环己基碳酰亚胺和N-羟基-琥珀酰亚胺为催化剂，将ε-聚赖氨酸交联到纤维表面实现抗菌水凝胶的制备，该水凝胶材料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和假单胞杆菌等的增殖均有良好的抑制作用。Shokri等人[71]以微晶纤维素为原料，以五甲基二乙烯三胺和甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯为改性剂，首先将微晶纤维素进行苄基化，然后采用均相ATRP法制备了一种新型氨基纤维素衍生物。抗菌实验表明，改性材料能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和肠炎沙门氏菌的增殖。

氨基化纳米纤维素已经用于饮用水的净化、食品包装材料的生产、药物的合成与制备以及生物医用抗菌材料等领域。研究表明，提高氨基化纳米纤维素表面所带的正电荷有利于增强其抗菌性能，但过量的正电荷也会增加材料本身的毒性，因此，如何控制纤维材料所带的电荷量既保持材料的抗菌性能，又保持材料的低毒性仍有待研究。同时，如何解决氨基化纳米纤维素表面正电荷引起机体的免疫应激问题，也仍需深入研究。

4 结 语

氨基化纳米纤维素是一种良好的工业原料，在食品和医药领域有广泛的应用，常用的氨基化纳米纤维素的制备流程大致分为纳米纤维素的制备和纳米纤维素的氨基化修饰。复杂的工艺流程会增加产品的生产成本和产品品质控制的难度，因此研究纤维素高效氨基化的方法，实现纤维素原料到氨基化纳米纤维素的直接制备，有利于提高氨基化纳米纤维素的品质。

氨基化纳米纤维素的抗菌性主要由氨基所带正电荷产生，将氨基化纳米纤维素用于食品、医用包装材料和用具，有利于降低材料的成本，但带有正电荷的粒子在体内会引起免疫反应，难以适用于机体内相关应用。通过控制纤维分子表面所带的电荷量和手性修饰的方法可以降低免疫系统对于正电荷粒子的排斥作用，因此，调控氨基化纳米纤维素表面所带的电荷量，调节氨基化纳米材料的手性，实现氨基化纳米纤维素在机体内抗菌的应用是值得关注的问题。