LPMO结合硫酸水解制备纤维素纳米晶体

岑 铭 王玉博 赵 蕾 李佩贤 崔博雅 周美怡 温洋兵 路福平 刘夫锋

（天津科技大学生物工程学院，天津，300457）

通常制备纤维素纳米晶体（CNC）主要为酸水解法[1-2]，其中多用质量分数60%左右的硫酸[3-4]。酸水解得到的CNC形态小、稳定性好，但水解时硫酸所需质量分数高，硫酸用量大，对机械设备腐蚀严重，且废液难以处理，污染生态环境。近年来，以生物酶辅助预水解结合酸水解制备CNC已有报道，Facundo等人[5]使用纤维素酶预水解结合硫酸制得CNC总得率和粒径均提高。而生物法现多采用复合酶水解[2]或单酶水解[6]等，具有废液处理方便、绿色环保等优点[7]，目前所用的酶主要以纤维素酶为主。

裂解性多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO）是铜离子依赖型氧化酶，根据序列差异在碳水化合物活性酶数据库（CAZymes,http://www.cazy.org/）中分为7类[8]，其中AA9家族是主要水解纤维素的氧化酶[9]。LPMO作用靶点为β-1,4-糖苷键，可氧化纤维素单元C1、C4处，得到的产物分别为醛糖酸、二元醇[10]，其中在C1位置氧化会产生1个可解离的羧基[11]，能增加纤维素电位，提高分散性[12]。此外，还有研究报道LPMO可在C6掺入氧，具体机理尚不明确[13]。与纤维素酶、聚木糖酶、果胶酶等水解酶相比，LPMO为氧化酶，需要外源电子还原活性位点的金属铜离子才能发挥活性。外源电子供体常用抗坏血酸、没食子酸等小分子还原剂。其次，LPMO可作用于纤维素结晶区，通过断裂β-1，4-糖苷键以产生更多还原端——纤维素酶的作用靶点，可加速纤维素酶水解效率[14]。利用LPMO制备纤维素纳米纤维已有报道。如Céline等人[6]通过LPMO水解桦木纤维，与聚木糖酶、外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶水解的纸浆对比，发现经LPMO水解得到的纳米纤维素表现出更好的凝胶稠度。Anthi等人[15]利用LPMO处理被囊动物外层纤维素被囊，制得高结晶度的纳米纤维素。结果表明LPMO水解可提高纳米纤维素得率，且在纤维素分子上插入的羧基能增加纳米晶体的表面电荷，促进纳米晶体形成。但要使酶保持良好活性，需要配置反应缓冲液，导致需要的化学试剂较多、生产成本较高，此外酶反应周期较长，因此利用生物法制备纳米纤维素仍有待进一步研究[11,16-17]。

本研究以棉溶解浆为原料，采用LPMO预水解，结合硫酸水解法制备CNC。通过对LPMO预水解前后棉纤维的微观形态变化和制得CNC的微观形态、粒径、结晶度等表征，以只有硫酸水解的CNC作为对照，初步探究了LPMO预水解对降低制备CNC时硫酸用量，以期为LPMO在CNC制备中的工业应用价值提供参考。

1 实验

1.1 实验原料

棉溶解浆，含97.0%的α-纤维素，原始聚合度为860，购于天津木精灵生物科技有限公司。裂解性多糖单加氧酶（LPMO），来源于真菌嗜热毁丝霉（My⁃celiophthorathermophilaC1）（GenBank：AKO82493.1），可氧化纤维素C1和C4位点。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸等均为分析纯。

机械搅拌器（RW20，德国IKA公司），X-射线衍射仪（Bruker D8 Advance，德国Bruker公司），溶解与颗粒电荷测定仪（PCD-04，德国BTG公司），激光粒度分析仪（LS13-320，美国Beckman Coulter公司），扫描电子显微镜（JSM-840，日本JEOL有限公司），原子力显微镜（Multimode 8 AFM，美国Bruker公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 LPMO的纯化

LPMO粗酶液中的甘油和杂质会抑制酶活性，因此利用磷酸缓冲液透析粗酶液，得到纯LPMO，具体步骤如下。

取磷酸氢二钠6.84 g、磷酸二氢钠2.20 g于烧杯中，加入超纯水1000 mL，搅拌直至完全溶解，制得pH值=6.0的磷酸缓冲溶液。取分子质量为3000 Da的透析袋，将适量粗酶液加入袋内密封，浸没于磷酸缓冲溶液中，透析2天，期间每12 h更换1次缓冲溶液。透析后于4℃冷藏保存。

1.2.2 LPMO预水解棉纤维

将棉溶解浆粉碎成40目粉状，称取200 g于5000 mL烧杯中，按顺序加入4000 mL的磷酸缓冲溶液（pH值=6.0）、LPMO（添加量为4 mg/g棉纤维）和400µL的抗坏血酸，将其置于60°C水浴，调节搅拌器速度为170 r/min，反应7天。反应过程中0、2、4、6、7天时取部分纤维用于SEM观察与羧基含量测定。反应结束后将样品煮沸灭活，抽滤并使用去离子水洗涤后收集。

1.2.3 硫酸水解法制备CNC

实验组CNC的制备：取10 g（绝干）LPMO预水解棉纤维和100 mL质量分数为60%、50%、40%的浓硫酸溶液分别在烧杯中混合均匀，在恒温恒速搅拌水浴锅（55℃，170 r/min）中分别反应2、3、4 h；将反应后的CNC混合液倒入1000 mL的烧杯中加水稀释至900 mL并用玻璃棒搅拌5 min以终止其反应；将CNC搅拌均匀后装入透析袋，在蒸馏水中进行透析，直至pH值为中性；透析后的CNC进行超声处理，4℃冰箱保存。

对照组CNC的制备：取10 g（绝干）棉纤维和100 mL质量分数60%的硫酸溶液放入烧杯中混合，在恒温恒速搅拌水浴锅(55℃，170 r/min)中反应2 h；终止反应和CNC提取步骤同上。

1.2.4 得率计算

使用烘干法对CNC溶液进行水分测定，CNC得率计算见公式(1)。

式中，X表示水分含量，g；mx表示CNC溶液质量，g；m表示硫酸水解前棉浆质量，g；m前表示LPMO预水解前棉纤维质量，g；m后表示LPMO预水解后棉纤维质量，g。

1.3 CNC表征

1.3.1 SEM分析

使用扫描电子显微镜（SEM）对LPMO预水解后的棉纤维表面形貌进行观察，以评价纤维表面的破坏程度。制样时将棉纤维配置成质量分数0.01%的分散液，经超声除颤后冷冻干燥。冻干的样品用导电胶粘贴在干净的铜片上，使用离子溅射镀膜机对其进行喷金处理，在10 kV加速电压下进行观察。

1.3.2 羧基含量测定

1.3.3 粒径分析将超声除颤后的CNC配置成质量分数0.1%分散液，使用激光粒度仪测定粒径。

1.3.4 AFM表征

取10 mL质量分数0.1%CNC分散液加入到90 mL无水乙醇溶液中，超声除颤。取20µL滴至云母片上，自然风干，云母片无样品面与铁片粘贴。样品用原子力显微镜（AFM）进行硅探针头测试（Scana⁃syst Air型号，115µm悬臂，叶尖半径2 nm，弹簧常数0.4 N/m，共振频率约70 kHz）。

1.3.5 FT-IR表征

取称0.001 g冷冻干燥后的CNC粉末与100 mg KBr混合研磨均匀后，压制成薄片，使用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对纯KBr晶体进行扫描，得到其红外光谱图作为背景峰，再对混合样品进行扫描，得到样品红外光谱图。

1.3.6 XRD分析

采用X-射线衍射仪（XRD）对干燥CNC粉末进行物相分析，测试角范围2θ=10°～90°。采用分峰法计算相对结晶度，使用软件MDI Jade 6进行拟合分峰，得到结晶区和非结晶区面积，通过公式(2)计算得出相对结晶度。

事业单位的本质为，国有资产出资创立、主要运营方向带有浓郁的社会公益色彩，并受到党的直接领导与管控，事业单位主要为学校等教育事业单位、医院等卫生事业单位组成。而因事业单位的特殊性决定，党对其掌控力度的强弱至关重要，而政工工作作为党控制事业单位的主要工作内容与表现形式，极大增强了事业单位中党的实际控制能力。

式中，XC表示相对结晶度；SK表示结晶区面积；SA表示非结晶区面积。

2 结果与讨论

2.1 LPMO预水解对棉纤维的影响

LMPO预水解对棉纤维外观形貌的影响如图1所示。由图1可看出，未经水解的棉纤维表面光滑，无凹痕褶皱；当预水解2天时，纤维表面开始出现横向的褶皱和纵向的划痕，这是由于LPMO开始附着在纤维素表面，随着搅拌带来的牵引力逐渐移动水解形成的痕迹，此时纤维素无定形区开始水解，结晶区开始软化；预水解4天时，单根纤维表面一层已经被破坏，纤维素粒径会因此减少；预水解6天，纤维表面被破坏，LPMO水解痕迹加深；预水解7天时，纤维表面出现大量深刻划痕，纤维结构显著破坏且伴有许多纤维素纳米纤丝（CNF）出现，这与Koskela等人[11]结论相符，证明利用LPMO可单独制备CNF。综上，LPMO可强烈破坏纤维结构，增加纤维表面粗糙度，增大比表面积，使硫酸与纤维水解接触位点增多。

图1 LPMO预水解时间对棉纤维表面形貌变化的影响（×10000）Fig.1 Effect of LPMO prehydrolysis time on surface morphology of cotton fiber（×10000）

LPMO的氧化作用会使纤维表面生成羧基基团，从而增加纤维负电性。因此常用纤维素的羧基含量来表征其水解程度。图2为羧基含量随LPMO预水解反应时间的变化。由图2可看出，随着LPMO预水解时间的增加，羧基含量持续上升，间接说明棉纤维表面破坏程度加剧。当LMPO预水解时间为2天时，棉纤维表面羧基含量迅速增加，为0.0617 mmol/g，当预水解时间大于2天时，羧基含量缓慢增加，预水解时间为7天时棉纤维羧基含量增加至0.0883 mmol/g。这可能是因为预水解前2天，棉纤维表面光滑无附着物，且酶活性处于最高时期，因此水解速率较快，羧基含量显著增加。随着时间的增加，棉纤维表面被破坏，酶存在空间位阻且活性开始快速下降[8]，因此水解速率下降，羧基含量增速下降。

图2 LPMO预水解反应时间对棉纤维羧基含量的影响Fig.2 Effect of prehydrolysis reaction time of LPMO on carboxyl content of cotton fiber

2.2 CNC的表征

2.2.1 宏观表征与得率

不同质量分数硫酸水解得到CNC分散液如图3所示。由图3可看出，LMPO预水解结合硫酸水解制备的CNC分散液随着硫酸质量分数的降低逐渐变得浑浊。预水解结合质量分数50%硫酸水解时，所得CNC分散液与对照组相接近，同样为泛蓝色的透明溶液，但是当硫酸质量分数降至40%时，CNC分散液变得浑浊。

图3 CNC宏观表征图Fig.3 Macro characterization of CNC

图4为不同CNC的得率。从图4可以看出，LPMO预水解结合硫酸水解对提高CNC得率有显著作用，与对照组CNC相比，预水解+50%硫酸制备的CNC得率增加18.4个百分点；预水解+60%硫酸制备的CNC得率增加19.4个百分点。LPMO在预水解过程中，首先进攻纤维素纤维的无定形区，而后氧化结晶区。预水解后一方面纤维结构受到破坏，比表面积增加；另一方面暴露出更多的结晶区，因此在酸处理过程中更易水解，从而实现得率的提升。

图4 CNC得率Fig.4 Crystal yield of CNC

2.2.2 羧基和磺酸基总含量

由于羧基、磺酸基均为负离子基团，所以使用电荷滴定仪滴定的电荷含量反应的是磺酸基和羧基总含量（以下简称基团含量）。不同水解体系得到的CNC中基团含量如图5所示。由图5可看出，当LPMO预处理结合质量分数60%硫酸水解时，制得的CNC基团含量最多，其主要原因是LPMO破坏纤维表面，增加了硫酸与纤维素的接触面，以及硫酸质量分数高，使得葡萄糖链中插入更多磺酸基团。但硫酸质量分数降为50%和40%时，基团总含量降低，小于对照组，这是因为硫酸质量分数降低，其水解能力下降[18]，单一硫酸水解时，质量分数＜50%时，多数纤维只能被降解至微米级[19]。羧基C=O吸收峰处无明显信号，这可能是因为本实验中LPMO在预水解时产生的羧基极少，因此在红外光谱图中羧基出峰不明显。

图5 CNC中羧基和磺酸基总量Fig.5 Total carboxyl and sulfonic groups of CNC

2.3 CNC性能分析

2.3.1 粒径分析与AFM分析

不同CNC平均粒径如图7所示。从图7可以看出，对照组CNC平均粒径为142 nm，而经LPMO预水解后结合质量分数60%硫酸制得的CNC平均粒径为120 nm，比对照组小22 nm；当硫酸质量分数50%时，CNC平均粒径为151 nm，对照组平均粒径高9 nm；硫酸质量分数降至40%时，所得CNC平均粒径较大，为234 nm。随着硫酸质量分数降低，平均粒径逐渐上升，这是因为硫酸质量分数下降后水解纤维素纤维的能力随之下降。

图7 CNC粒径分析Fig.7 Particle size analysis of CNC

2.2.3 红外光谱分析

图6为CNC红外光谱图。由图6可知，3200 cm-1左右处为纤维素分子—OH的吸收峰，在1050 cm-1处有1个葡萄糖碳环C—O伸缩振动峰，这2个峰确定样品为纤维素[20]。1630 cm-1处有水分子—OH的弯曲振动峰，1390 cm-1左右处是C—H的弯曲振动峰。1200 cm-1处对应磺酸基吸收峰。从图6中还可看出，4个样品在1200 cm-1右旁均有小峰出现，这表明4个样品都含有一定量的磺酸基。而1735 cm-1左右处的

图6 CNC红外光谱图Fig.6 Infrared spectra of CNC

图8为CNC的AFM图。纤维素的任一维尺寸减小至100 nm以内即视为制得纳米纤维素[21]，图8中比例尺显示，4个CNC样品中大多数纤维直径小于100 nm，呈棒状，属于纤维素纳米晶体。由图8(a)和图8(b)可知，同等质量分数硫酸水解时，棉纤维经LPMO预水解后的CNC长度与直径均比对照组小。图8(a)中CNC有堆积重叠的现象，而图8(b)中CNC则没有堆积重叠，该现象表明经LPMO预水解得到的CNC具有更好的分散性。由图8(c)可知，LPMO预水解结合质量分数50%硫酸水解制得的CNC同样呈较好的分散状态，晶体尺寸分布均匀，大小与对照组接近，符合纤维素纳米晶体的要求。由图8(d)可知，LPMO预水解结合质量分数40%硫酸水解得到的CNC尺寸较大，分散性较差，这与粒径测量结果和宏观表征一致。

图8 CNC的AFM图Fig.8 AFM images of CNC

2.3.2 结晶度分析

纤维素Ⅰ型结构中有4个晶面，分别为纤维素的（110）（110）（002）（004）4个晶面，分别对应15.09°、16.86°、23.08°、34.40°处的衍射峰。不同CNC的X-射线衍射图和相对结晶度分别如图9和表1所示。由图9可看出，经LPMO预水解制得的CNC仍为纤维素Ⅰ型结构，与对照组一致，说明LPMO预水解和硫酸水解不会影响最终产物晶型。由表1可知，对照组CNC的相对结晶度为59.8%，经LPMO结合质量分数60%硫酸水解所制得的CNC相对结晶度为68.6%；LPMO结合质量分数50%硫酸水解所制得的CNC相对结晶度为66.2%；LPMO结合质量分数40%硫酸水解所制CNC相对结晶度为70.4%；比对照组分别提高了8.8、6.4和10.6个百分点。这可能是由于LPMO对纤维素结晶区的作用[11]，当LPMO预水解完成后，纤维素结晶区内部排列较为疏松的区域暴露，有助于硫酸水解。此外，硫酸质量分数也会影响结晶度大小，有研究表明，在45℃下，硫酸质量分数大于63.5%则会降低结晶度；在质量分数为50%～63.5%时，结晶度变化曲线趋于平稳[18]。因此可推测，促使CNC结晶度提升主要为LPMO的预水解作用。

图9 CNC的XRD图Fig.9 XRD pattern of CNC

表1 CNC相对结晶度Table 1 Relative crystallinity of CNC

3 结论

本研究使用裂解性多糖单加氧酶（LPMO）预水解棉溶解浆，再通过硫酸水解制得了CNC，并对其进行了表征。

3.1 通过SEM与羧基测定结果表明，LPMO可破坏棉纤维表面，提高羧基含量，但是预水解时间长达7天，耗费时间较长。

3.2 同样质量分数为60%硫酸水解时，先经过LPMO预水解所得的CNC相比只硫酸水解制备的CNC得率提高19.4个百分点，羧基和磺酸基总量略增，平均粒径减少22 nm，结晶度提高8.8个百分点；在同样LPMO预水解后，随着硫酸质量分数降低，CNC的得率和羧基与磺酸基总量随之减少，平均粒径随之升高，而结晶度与硫酸质量分数无明显关系。

3.3 从LPMO的作用效果来看，将LPMO预水解后结合质量分数50%硫酸水解的CNC与对照组相比，平均粒径增加9 nm，羧基和磺酸基总量略下降，而结晶度提高6.4个百分点，得率提高18.4个百分点。此外根据AFM表征显示，50%硫酸水解的CNC已经达到纳米水平。因此可得出LPMO可促进硫酸水解，使其所需质量分数降低至50%。

综上，LPMO预水解加硫解水解能提高CNC性能，增加得率，降低所需硫酸质量分数，在CNC工业化生产方面具有重要价值。但是LPMO处理周期长，且预水解反应体系所用的试剂较多，故利用LP⁃MO预水解以制备CNC的方法距离工业应用还需要进一步研究。