阿霉素联合姜黄素抑制脑胶质瘤细胞增殖研究

李 岳 张志强 陈 亚 徐 瑶 王 琳*

(1. 佳木斯大学研究生院，黑龙江 佳木斯154007；2. 佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154002)

胶质瘤是起源于中枢神经系统的恶性肿瘤，可致命损害中枢神经系统[1]，通常发生在颅脑深处，常浸润到邻近的正常脑组织，治疗起来非常困难[2]。化疗多采取全身系统给药，在抗肿瘤的过程中也会伤害正常组织细胞，甚至出现严重的毒副作用，如骨髓抑制、肝肾毒性、过敏反应、脱发、恶心、呕吐等[3-5]。单一用药易使肿瘤细胞产生耐药性，因此，临床上常采用联合用药的方法治疗恶性肿瘤[6-8]。寻找安全有效并且耐药性低的药物成为现阶段肿瘤治疗的热点，同样，如何低毒、高效的治疗肿瘤俨然成为研究的热点问题。阿霉素在与其他抗肿瘤药物连用过程中取得不错的效果；天然有机小分子化合物姜黄素已被证实具有显著抗肿瘤、抗炎等多种功效[9]，同时，姜黄素中所含有的一种活性成分阿魏酸钠，具有改善脑微循环的作用，并且毒副作用极低[10]。

1 实验材料与仪器

U251细胞(武汉细胞库)，CCK-8(碧云天生物)，阿霉素(Dox)、姜黄素(Cur,北京索莱宝科技有限公司)，全自动酶标仪(美国Bio-TEK公司)，凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)，P53(博士德生物公司)。

2 实验方法

2.1 CCK-8实验

将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度。于96孔板各孔中加入100微升悬液，接种密度为1.25万/孔，置于培养箱48 h。阿霉素浓度梯度为1、2、 3、 4 、5 μg/L；姜黄素浓度梯度为0、25、50、75、100、125 μg/L。将两药分别加入96孔板，每个浓度设置5个复孔，培养24、48 h。然后在每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续在培养箱中孵育2 h，酶标仪检测吸光度值。确定最适浓度后，阿霉素和姜黄素按1/4∶1/4、1/2∶1/2、1∶1的浓度比例对细胞重复上述实验。

2.2 蛋白免疫印迹检测

提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜在5%脱脂奶粉的溶液中封闭1 h，分别与P53(1∶1 000)，β-actin(1∶2 000)，冰箱4 ℃冷藏过夜。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗，37 ℃孵育1 h。最后用全自动化学分析成像系统进行检测。以β-actin作为蛋白参照，检测各目的蛋白条带灰度值，从而确定相应蛋白表达量。

3 统计学处理

实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析。所有数据均采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。当P<0.05，数据差异才具有统计学意义。

4 实验结果

4.1 阿霉素和姜黄素对U251细胞增殖的影响

阿霉素和姜黄素分别作用细胞48 h后，不同浓度的两种药物对U251细胞增殖具有明显的抑制作用，分别如表1和表2所示。随着药物浓度的增高，细胞存活率明显降低。当阿霉素浓度为1 μmol/L；姜黄素浓度为3 μmol/L时，细胞存活率约为50%。

表1 不同浓度阿霉素对U251细胞存活率的影响Tab. 1 Effects of different concentrations of doxorubicin on the survival rate of U251 cells

表2 不同浓度姜黄素对U251细胞存活率的影响Tab. 2 Effects of different concentrations of curcumin on the survival rate of U251 cells

4.2 阿霉素联合姜黄素对U251细胞增殖的影响

与正常对照组和单独用药组相比，两药联合显著降低细胞存活率，如表3所示。U251细胞在阿霉素和姜黄素浓度为比例为1∶3时抑制效果最明显。

表3 DOX联合姜黄素对U251细胞存活率的影响Tab. 3 Effect of DOX combined with curcumin on the survival rate of U251 cells

4.2 阿霉素和姜黄素对U251细胞P53蛋白表达的影响

如图1示，与对照组相比，阿霉素、姜黄素以及两药联合均可以提高P53蛋白表达量(p<0.05)，两药联合治疗尤为显著(p<0.01)。

图1 不同用药下P53蛋白表达情况Fig. 1 P53 protein expression under different medications

5 讨论

脑胶质瘤属于人类发病率最高的颅内肿瘤，具有多中心发生、侵袭生长、富含血管及易转移等生物学特点[11-12]。目前，脑胶质瘤的典型治疗手段是手术为主，辅助放疗、化疗相结合。阿霉素作为临床一线化疗药物因其严重的心肌毒副作用影响其临床应用。本文通过中西药联合的方式增加药物的抗肿瘤的作用，为临床肿瘤治疗的新方案提供依据，在一定程度上防止肿瘤复发、转移。本文实验结果表明，阿霉素和姜黄素对U251细胞的抑制呈现时间浓度依赖性，而且二者联用具有协同作用，比两者单独用药抑制率更高。