UHPLC-MS/MS同时测定黄芩清热除痹胶囊中6种活性成分

董心同，甘珮荣，柯江涛，陈芳园，吴 虹，陈 建，刘 健

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230012；3.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；5.安徽中医药大学第一附属医院风湿科，安徽 合肥 230031)

黄芩清热除痹胶囊(Huangqin Qingre Chubi Capsule, HQC)作为安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂，由黄芩、栀子、威灵仙、薏苡仁、桃仁5味中药组成。该方从脾论治痹证，发挥健脾化湿、清热通络功效，临床广泛用于因风寒湿热引发的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、强直性脊柱炎、痛风性关节炎等免疫系统疾病。虽然HQC的临床疗效确切，但目前其质量控制指标的研究尚属空白。

多成分协同作用是中药复方发挥药效的方式。黄芩和栀子的有效成分黄芩苷和栀子苷在抗炎、抗氧化应激功效中具有重要作用，有报道称黄芩苷在溃疡性结肠炎大鼠模型中调节Th17/Treg平衡，抑制肠组织中活性氧、丙二醛水平。栀子苷介导RhoA/p38MAPK/NF-κB/F-actin信号传导，减弱脂多糖诱导的成纤维滑膜细胞高通透性，调节促炎细胞因子白细胞介素-1β和抗炎细胞因子(白细胞介素-4,转化生长因子β1)的相对平衡。研究表明，威灵仙的有效成分齐墩果酸具有抗炎、调节免疫、抗氧化的作用，其另一活性成分木犀草素通过抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-кB)介导的炎症反应以及激活核因子E2相关因子2参与的抗氧化反应保护糖尿病小鼠的心脏。薏苡仁提取的多酚薏苡素通过抑制NF-κB、NOD样受体蛋白3炎症小体激活发挥抗炎作用。桃仁的指标性成分苦杏仁苷可调节多种炎症细胞因子介导的通路，减轻动脉粥样硬化、糖尿病肾病模型大鼠症状。本研究依据HQC组成及药理活性确定多种质量控制指标，建立超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS)/MS法，为HQC质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AB SCIEX ExionLC AD型超高效液相色谱仪：美国AB SCIEX公司；AB SCIEX QTRAP 5500三重四极杆质谱联用仪：美国AB SCIEX公司；Analyst1.7.0软件数据系统：美国AB SCIEX公司；Milli-Q Gradient A10超纯水器：美国MILLIPORE公司；KQ-7-200 DTD超声波清洗机(功率200 W，频率80 kHz)：巩义市予华仪器有限责任有限公司；ME204电子天平：瑞士METTLE TOEDO公司。

1.2 试药 黄芩苷(批号DSTDH002301，纯度98%)：成都乐美天医药科技有限公司；栀子苷(批号110749-200714，纯度98%)：中国食品药品检定研究院；齐墩果酸(批号110709-200304，纯度98%)：中国食品药品检定研究院；木犀草素(批号CHB180113，纯度98%)：成都克洛玛生物科技有限公司；薏苡素(批号CHB201103，纯度98%)：成都克洛玛生物科技有限公司；苦杏仁苷(批号DST200710-004，纯度98%)：成都乐美天医药科技有限公司；样品HQC均由安徽中医药大学第一附属医院提供；水为超纯水；质谱分析用甲酸、甲醇和乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷1.99 mg、栀子苷1.00 mg、齐墩果酸2.28 mg、木犀草素2.00 mg、薏苡素1.12 mg、苦杏仁苷2.01 mg对照品，分别置10 mL容量瓶，加甲醇溶解定容，制成浓度分别为0.199、0.100、0.228、0.200、0.112、0.201 mg/mL的对照品储备液。精密吸取适量的各对照品储备液，加甲醇逐级稀释，制成分别含黄芩苷4.98 μg/mL、栀子苷1.00 μg/mL、齐墩果酸1.14 μg/mL、木犀草素0.010 0 μg/mL、薏苡素0.011 2 μg/mL、苦杏仁苷0.101 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 供试品溶液Ⅰ 取本品内容物适量，研细，取细粉1.00 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇-水100 mL，称定质量，超声(功率200 W，频率40 kHz)处理30 min，冷却至室温后称质量，以50%甲醇水补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅰ，精密吸取供试品溶液Ⅰ适量，加50%甲醇逐级稀释，分别用于定量检测不同物质，稀释100倍用于检测黄芩苷、栀子苷，稀释1 000倍用于检测木犀草素、苦杏仁苷，稀释10 000倍用于检测薏苡素。

2.2.2 供试品溶液Ⅱ 参考2020年版《中华人民共和国药典》威灵仙的质量标准含量测定方法制备供试品溶液Ⅱ。取本品内容物研细，取约1.00 g，精密称定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯适量，加热回流3 h，弃去乙酸乙酯液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒转移至锥形瓶，精密量取稀乙醇50 mL加入，称质量，加热回流1 h，放冷后再称质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，置水浴上蒸干，残渣加2 mol/L盐酸溶液30 mL使之溶解，加热回流2 h，冷却后移入分液漏斗中，用10 mL水分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次15 mL，合并提取液，70 ℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅱ，精密吸取供试品溶液Ⅱ适量，加甲醇稀释1 000倍用于检测齐墩果酸。

2.3 色谱-质谱条件

2.3.1 色谱条件 采用Phenomenex Luna Omega C色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)，以含10 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸的乙腈(B)为流动相，洗脱梯度:0～0.5 min，5% B；0.5～1.5 min，5%～40% B；1.5～3.0 min，40% B；3.0～4.5 min，40%～100% B；4.5～6.5 min，100% B；6.5～8.5 min，100%～5% B；8.5～10 min，5% B。每次进样前预平衡3 min，再进行洗脱程序，流速0.25 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL。

2.3.2 质谱条件 采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)的扫描方式，离子源为电喷雾离子源，负离子模式。离子化电压为-4 500 V，离子源温度为450 ℃，喷雾气为379 kPa，辅助气为448 kPa，气帘气为172 kPa，碰撞气压力为中等。黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷6种待测化合物的质谱条件见表1。

表1 UHPLC-MS/MS同时测定6种活性成分质谱参数

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 精密吸取混合对照品溶液和稀释后的供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.3”项下条件进行测定，MRM色谱图见图1。上述色谱-质谱条件下，稀释后的供试品溶液Ⅰ、Ⅱ中各待测成分与6个对照品保留时间一致。各测定成分分离效果良好，无其他杂质干扰，表明本法专属性良好。

图1 混合对照品溶液(A)、供试品溶液(B)的MRM色谱图

2.4.2 线性关系考察 取“2.1”项下混合对照品溶液适量，依次向下稀释2、8、16、32、64倍，按“2.3”项下条件进样分析，以对照品浓度(

x

)为横坐标、峰面积(

y

)为纵坐标，进行加权(1/

x

)线性回归，计算得到各成分回归方程。将混合对照品溶液逐步稀释并进行测定，并以信噪比S/N=3和S/N=10时各对照品的量作为检测限(levels of detection,LOD)和定量限(limit of quantity,LOQ)。结果显示，6种活性成分在各自线性范围内具有良好线性关系，见表2。

表2 6种活性成分的线性关系考察

2.4.3 精密度试验 取“2.1”项下混合对照品溶液，加甲醇稀释8倍，精密吸取稀释后的混合对照品溶液适量，按“2.3”项下条件连续进样6次，记录各成分峰面积，结果黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷峰面积的RSD分别为1.07%、2.06%、0.940%、2.62%、3.14%、1.17%，表示仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.3”项下条件分别于0、3、6、10、15、24 h进样分析，记录黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷色谱峰面积，结果各成分峰面积的RSD(

n

=6)分别为0.600%、3.07%、1.11%、1.15%、3.36%、1.39%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.4.5 重复性试验 取同一批次的样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ各6份，按“2.3”项下条件进样分析，记录峰面积，计算含量。结果黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷峰面积的RSD(

n

=6)分别为2.45%、3.61%、1.48%、3.74%、3.35%、1.45%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取同一批已知含量的HQC样品9份，每份取约1.00 g，精密称定，按每3份为一组，每组精密加入对照品黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷的量相当于HQC样品中各对照品含量的50%、100%、150%，按“2.2”项下方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，精密吸取各供试品溶液5 μL，按“2.3”项下条件进样分析，测定峰面积，分别计算6种成分加样回收率和RSD。结果显示，黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷平均加样回收率分别为98.62%、100.2%、102.9%、103.7%、100.7%、100.5%，RSD分别为2.53%、1.85%、2.70%、2.15%、1.96%、2.18%。结果表明该方法准确度良好。

2.5 样品含量测定 取供试品3批，每批取3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.3”项下条件测定，分别计算每粒胶囊中黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷的含量。3个批次含量测定中，每粒胶囊中黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷的含量分别为(2.860±0.046)mg、(0.164±0.010)mg、(0.159±0.010)mg、(0.104±0.010)mg、(0.126±0.011)mg、(0.318±0.018)mg。其中黄芩苷含量最高，栀子苷、齐墩果酸、苦杏仁苷、薏苡素含量次之，木犀草素含量较低。不同批次样品中6种成分含量差异较小，质量较稳定。见表3。

表3 3批次样品6种成分含量测定结果

3 讨论

3.1 含量测定方法的建立 中药复方质量控制是保障复方制剂安全有效的基础。HQC具有明显抗炎、抗氧化应激的药理活性，但目前尚未有关于HQC有效成分鉴别及含量测定的研究。查阅相关含量测定方法的文献发现，Liu等将龙胆泻肝丸中黄芩苷和栀子苷作为黄芩和栀子的质量控制指标，采用高效液相色谱-二极管阵列及电喷雾串联质谱联用对其鉴定与测定。高晓洁等采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定威灵仙类药材中齐墩果酸的含量，为威灵仙药源提供了参考。有研究采用HPLC建立桃仁及其炮制品的指纹图谱，测定苦杏仁苷的含量。杨阳等应用HPLC测定不同产地薏苡中薏苡素含量，辨识药材品质。但以上研究多以单指标成分作为质量控制检测指标，难以全面反映中药质量。本研究采用UHPLC-MS/MS技术同时定量分析HQC中6种活性成分，为HQC质量控制提供稳定分析方法。

3.2 样品处理方法的选择 本研究考察了提取方法、提取溶剂、提取时间对6种待测成分提取的影响。首先采用超声处理并分别以甲醇、50%甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜为提取溶剂，结果50%甲醇超声处理作为提取溶剂时黄芩苷、栀子苷、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷峰面积较大，杂质相对较少，提取效率最高，操作简单，而齐墩果酸未检出，原因可能是齐墩果酸在药材中含量较少，且多以苷和游离态形式存在。因此，本实验参考2020年版《中华人民共和国药典》威灵仙中齐墩果酸含量测定的方法，采用索氏提取法，酸水解后用乙酸乙酯提取，结果齐墩果酸被检出，余下待测成分虽部分被检出，但均低于超声提取时色谱峰响应值。此外，分别考察了20、30、60 min超声提取时间对HQC活性成分提取的影响，结果发现与超声20 min时比较，超声30 min时供试品溶液Ⅰ待测成分含量高，超声30、60 min时，供试品溶液Ⅰ待测成分含量无明显变化。因此，最终确定最佳提取条件为50%甲醇为提取溶剂，超声处理30 min，供试品溶液Ⅱ最佳提取条件参考2020年版《中华人民共和国药典》威灵仙质量标准中含量测定的方法。

3.3 色谱条件的选择 为获得最佳分离效果，实验优化了流动相组成、梯度洗脱条件、流速。分别对0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、含10 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液-乙腈、含10 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸的乙腈进行考察，发现乙腈作为洗脱液时，HQC中目标成分响应相对较强，峰形尖锐，基线噪音显著降低。此外，调整流动相pH值，加入0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵使色谱峰响应增强、拖尾减少。最终采用含10 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸的乙腈(B)进行梯度洗脱。

3.4 质谱条件的选择 为满足多成分同时定量的需求，选用MRM扫描模式下正负离子同时检测，发现负离子模式使6种目标化合物在检测条件下更稳定，响应值更佳。此外，分别优化了各待测成分的去簇电压和碰撞能量以获得响应强度较高的色谱峰。

本研究建立了HQC中黄芩苷、栀子苷、齐墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷6种活性成分的含量测定方法，其分析时间短、专属性好、重复性好、稳定性高，可为HQC的质量控制提供可靠的分析方法。