血管软化丸调控miR-17-5p与PCSK9/VLDLR信号通路抗动脉粥样硬化研究

孔艳芳，秦合伟，，王 媛，胡长春

(1.河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002；2.河南中医药大学，河南 郑州 450002)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是导致缺血性心脑血管疾病的主要病理基础，目前西医防治AS的临床效果不理想，而中医药防治AS取得了一定的成果，但具体作用机制不明确；新近研究发现微小RNA(microRNA，miR)参与了AS的发生、发展，其中miR-17-5p能够通过抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)极低密度脂蛋白受体(very low density lipoprotein receptor，VLDLR)的表达，影响前蛋白转化酶枯草溶菌素(proprotein convertase subtillisin/kexin type 9，PCSK9)的表达，进而负调控VLDLR表达，缓解血管内膜的增生，抑制血管管腔狭窄和平滑肌细胞的增殖迁移，抑制AS的形成。鉴于最新研究进展和本课题组前期研究基础，笔者推测中医药防治AS的作用机制可能与调控miR-17-5p，靶向调控VLDLR或靶向调控PCSK9有关。因此，本研究旨在观察血管软化丸抗AS的作用机制是否与靶向调控miR-17-5p，靶向调控VLDLR或靶向调控PCSK9间接调控VLDLR，抑制血管炎症反应，减轻VSMC有关。

1 材料

1.1 实验动物 健康雄性ApoE小鼠60只，SPF级，体质量(20±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。健康雄性C57BL/6小鼠15只，体质量(20±2)g，购自南京大学模式动物研究所，生产许可证号：SCXK(苏)2015-0001；SD大鼠60只，体质量(300±20)g，雄性，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，动物生产许可证号：SCXK(豫)2019-0002。所有动物饲养于河南中医药大学第二附属医院动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK(豫)2016-0009，(22±1)℃恒温、60%～75%恒湿、12 h循环照明，自由摄食、饮水。人VSMC购自上海沪震生物科技有限公司。

1.2 伦理审查 经河南中医药大学第二附属医院动物实验伦理委员会审核通过，本实验设计方案符合安全性和公平性原则，实验动物符合国家对医学实验动物的有关要求。伦理审核批准标号：20190622。

1.3 实验药物 本研究所用血管软化丸(药物组成：山楂、神曲、珍珠、代赭石各30 g，莱菔子、茯苓、枸杞子各15 g，陈皮、连翘、郁金、三七各12 g、清半夏9 g)方中所有中药均来源于河南中医药大学第二附属医院药剂科；按照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算低、高2个剂量分别为21.6、86.4 g/kg，分别相当于60 kg成人临床用量等效量的5.8、23.3倍，医院煎药房按照要求煎煮成生药含量为0.864、3.456 g/mL。

1.4 含药血清制备 SD大鼠高剂量组(20只)灌胃给予血管软化丸高剂量制备高剂量含药血清；SD大鼠低剂量组(20只)灌胃给予血管软化丸低剂量制备低剂量含药血清；每日早晚2次灌胃，连续灌胃5 d。空白血清对照组(20只)给予等量的生理盐水灌胃，每日2次；各组大鼠末次灌胃后1 h，给予腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，37 ℃静置1 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，放入离心管中，0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

2 方法

2.1 细胞实验

2.1.1 VSMC培养和分组 VSMC在含有15%(

V/V

)热灭活胎牛血清的DMEM培养基(含有100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)中培养，以每孔1×10/mL的细胞数将细胞铺板于24孔板，37 ℃、5% CO的环境下培养，通过加入氧化低密度脂蛋白(oxidation low lipoprotein，Ox-LDL)20 μg/mL构建平滑肌细胞损伤模型。模型复制成功后分为4组：(1)模型组：VSMC+Ox-LDL+不含药正常血清；(2)miRNA-17-5p抑制剂组：VSMC+Ox-LDL+HiperFect转染试剂，将RNA-17-5p抑制剂转染VSMC；(3)含药血清高剂量组：VSMC+Ox-LDL+中药高剂量含药血清；(4)含药血清低剂量组：VSMC+Ox-LDL+中药低剂量含药血清。干预48 h后观察收集细胞总RNA和总蛋白进行相应指标检测。

2.1.2 血清干预和细胞转染的具体方法

(1)血清干预：将第3～5代VSMC弃去培养基，用PBS温和洗3遍，在37 ℃、5% CO孵箱中培养16 h，观察到每孔内细胞铺板率达50%，弃掉孔内旧培养基，分别加入血管软化丸不同浓度(6.25、12.5和25 μg/mL)含药血清的RPMI1640培养基，最终选取25 μg/mL含药血清，进行含药血清干预。

(2)细胞转染：在无菌条件下，用含有10% FBS的细胞培养基DMEM，将VSMC(1×10/mL)接种于6孔板，每孔含有2 mL培养基；37 ℃温度下在5% CO细胞培养箱中孵育备用；取miR-17-5p抑制剂，以0.6 μL(20 mol/L)和HiPerFect转染试剂12 μL滴加入300 μL的不含FBS和抗生素的DMEM细胞培养基，混合为浓度5 μmol/L在室温条件下放置5～10 min形成转染复合物，将转染复合物均匀滴入上述接种VSMC培养基中，孵育直至血管内皮细胞融合度约80%时终止培养，刮取细胞，以提取血管内皮细胞的RNA。经qRT-PCR检测，细胞转染成功率为70%。

2.1.3 四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)法检测细胞活性 收集各组细胞并调整密度为每孔2×10个细胞，接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养24 h后加入MTT 20 μL(浓度为5 mg/mL)，培养箱孵育4 h后取出，弃上清，加入二甲基亚砜150 mL，摇床震荡10 min后，于490 nm波长测定吸光度(

A

)值。

2.1.4 检测细胞miR-17-5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表达水平 采用RT-PCR法：收集血清处理48 h后的细胞，提取总RNA，逆转录，采用SYBR Green进行qRT-PCR反应；反应参数：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40个循环，样本中目的基因的计算方法为2-ΔΔ。GAPDH为内参。引物序列：miR-17-5p正向引物5′-CCAGCCAAAGTGCTTACAGTGC-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；VLDLR正向引物5′-CCCGTTCTACTCAGTGTATCCC-3′，反向引物5′-CTGCCATCGTCACAGTCATCC-3′；PCSK9正向引物5′-GCGTCGTGGTGATTGGATTG-3′，反向引物5′-CAGGGGTGTTGTGGATGCT-3′；GAPDH正向引物5′-AGTGTGACGATTAATCGCAAG-3′，反向引物5′-ATCCACATCTC TCGTTGTGGC-3′。

2.1.5 Western blot法检测细胞VLDLR和PCSK9蛋白表达水平 收集处理48 h后的细胞，提取蛋白，采用BCA蛋白定量法，蛋白电泳，分离，转膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，用相应的一抗(VLDLR和PCSK9)，分别按照1∶200和1∶500孵育，4 ℃过夜，洗涤后标记二抗(滴度1∶200)杂交。采用化学发光试剂盒检测，使用Image Lab 4.1图像分析软件检测VLDLR和PCSK9印迹条带净吸光度值，以β-actin内参照，结果以样本灰度值/内参照灰度值表示。

2.2 体内实验

2.2.1 模型复制与给药 C57BL/6小鼠给予全程普通饲料喂养，作为正常对照组；ApoE小鼠给予全程高脂饲料(含脂肪21%、胆固醇0.15%)喂养，分为4组，每组15只；饲养8周模型复制成功(每组随机抽取1只小鼠主动脉壁可见明显的斑块形成)后开始干预。每日灌胃1次，连续干预8周后取材进行检测。①对照组：C57BL/6小鼠给予等量生理盐水灌胃；②模型组：ApoE小鼠给予等量生理盐水灌胃；③miR-17-5p 抑制剂组：ApoE小鼠尾静脉注射miR-17-5p抑制剂处理；④血管软化丸高剂量组：ApoE小鼠采用血管软化丸灌胃量为86.4 g/(kg·d)；⑤血管软化丸低剂量组：ApoE小鼠采用血管软化丸灌胃量为21.6 g/(kg·d)。

2.2.2 样品采集和病理形态学观察 经药物干预8周后取材，禁食12 h后摘眼球取血，用于血清指标检测；取胸腹全长主动脉，一部分主动脉固定于4%甲醛溶液中，用于HE染色；一部分置于-80 ℃冻存用于主动脉相关指标检测。

2.2.3 ELISA法测定外周血清中白细胞介素-6 (interleukin- 6，IL-6)、白细胞介素-10 (interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子水平 采用ELISA法检测血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平，按ELISA试剂盒说明书进行。

2.2.4 RT-PCR检测各组主动脉miR-17-5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表达水平 将主动脉称量后，加入适量的Trizol，提取总RNA。具体方法见“2.1.4”项。

3 结果

3.1 一般情况 动物模型鉴定时每组各处死1只，除去撕咬致死5只，灌胃致死6只，剔除各组离群值，各组进入统计数量均为10只。

3.2 各组VSMC存活率比较 与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组，血管软化丸高、低剂量含药血清组VSMC存活率均明显升高(

P

<0

.

05)。见图1。

注： A.模型组；B.miR-17-5p抑制剂组；C.血管软化丸高剂量组；D.血管软化丸低剂量组；与模型组比较，*P<0.05；与miR-17-5p抑制剂组比较，#P<0.05

3.3 VSMC中miR-17-5p、VLDLR、PCSK9 mRNA表达水平比较 与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组，血管软化丸高、低剂量含药血清组VSMC中miR-17-5p和VLDLR mRNA表达水平均明显升高(

P

<0

.

05)，PCSK9 mRNA表达水平明显降低(

P

<0

.

05)；血管软化丸高、低剂量含药血清组miR-17-5p、VLDLR、PCSK9 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(

P

>0

.

05)。见表1。

表1 各组VSMC中miR-17-5p、VLDLR、PCSK9 mRNA表达水平比较

3.4 各组VSMC内VLDLR、PCSK9蛋白表达水平比较 与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组，血管软化丸高、低剂量组VSMC中VLDLR蛋白表达水平均明显降低(

P

<0

.

05)，VSMC中PCSK9蛋白表达水平均明显升高(

P

<0

.

05)；血管软化丸高、低剂量组各项指标比较，差异均无统计学意义(

P

>0

.

05)。见表2和图2。

表2 各组VSMC中VLDLR、PCSK9蛋白表达水平比较

注：A.模型组；B.miR-17-5p抑制剂组；C.血管软化丸高剂量组；D.血管软化丸低剂量组

VLDLR

和

PCSK9

蛋白表达水平

3.5 主动脉病理形态观察 光学显微镜下观察发现，模型组小鼠主动脉管径厚薄不均匀，内膜不光滑，管腔内可见明显AS斑块形成，斑块内可见浅染无定形物和钙化颗粒物，部分AS斑块截面积大于主动脉截面积。miR-17-5p抑制剂组和血管软化丸高、低剂量组AS病变程度明显较模型组减轻。见图3。

图3 各组小鼠主动脉病理形态(HE染色，10×20倍)

3.6 各组小鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比较 与对照组比较，模型组小鼠血清IL-6和TNF-α水平明显升高(

P

<0

.

05)，IL-10水平明显降低(

P

<0

.

05)；与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组和血管软化丸高、低剂量组血清IL-6和TNF-α水平明显降低(

P

<0

.

05)，IL-10水平明显升高(

P

<0

.

05)。血管软化丸高、低剂量组各项指标比较，差异均无统计学意义(

P

>0

.

05)。见表3。

表3 各组小鼠外周血IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

3.7 各组主动脉miR-17-5p、VLDLR、PCSK9 mRNA表达水平比较 与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组，血管软化丸高、低剂量组主动脉miR-17-5p、VLDLR mRNA表达水平均明显降低(

P

<0

.

05)，主动脉PCSK9 mRNA表达水平明显升高(

P

<0

.

05)；血管软化丸高、低剂量组miR-17-5p、VLDLR、PCSK9 mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(

P

>0

.

05)。见表4。

表4 各组主动脉miR-17-5p、VLDLR、PCSK9 mRNA表达水平比较

4 讨论

miRNA在AS的发生发展过程中发挥了重要的作用，人为调控miRNA的表达也是疾病防治的一个重要方法，其中miRNA-17-5p的表达水平与AS严重程度密切相关。有研究发现，低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein，recptor,LDLR)能够通过结合并内吞低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL) 调节胆固醇代谢，在LDLR数量降低时将导致血浆中LDL和胆固醇水平升高；VLDLR主要分布在心肌、骨骼肌以及脂肪组织中，能够通过与含有载脂蛋白E的脂蛋白结合，调节脂质代谢；巨噬细胞膜上VLDLR通过摄取富含三酰甘油的脂蛋白，促进三酰甘油在细胞中的沉积，导致和加重AS。此外，在粥样斑块存在情况下，研究者通过高表达VLDLR，结合低脂饮食，能够降低血浆中VLDL及LDL水平，促进AS斑块消退。

研究发现，PCSK9能够影响VLDLR的表达，增强肝脏中VLDLR的溶酶体和内涵体降解，导致血清低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)水平升高；研究者通过转染PCSK9进入VSMC，发现提高PCSK9表达能够降低VLDLR蛋白水平。新近研究发现，AS发病与miR-17-5p表达成正相关，与VLDLR表达成负相关；miR-17-5p能够靶向VLDLR，直接抑制VSMC中VLDLR的表达，MiR-17-5p通过影响PCSK9参与负调控VLDLR表达，抑制AS的发生发展。

高脂血症和AS可归属于中医“血浊”和“脉痹”范畴，痰、瘀等病理产物壅塞脉道，沉积脉壁，痰瘀蓄留不去而成“脉痹”，即AS和血栓形成。本课题组针对AS“痰阻血瘀”的基本病机，采用由保和丸加减化裁而成的血管软化丸治疗AS。该方中山楂消饮食积滞、活血化瘀为君药；神曲消食健胃，莱菔子理气消食，半夏、茯苓燥湿健脾、化痰散结，郁金、三七行气解郁、活血化瘀，枸杞子滋补肝肾、益精明目，珍珠和代赭石平肝潜阳、降逆祛痰，共为臣药；陈皮理气和中为佐药；甘草调和诸药。诸药合用，共奏消积化痰、活血化瘀之功。本课题组既往研究发现，血管软化丸防治AS与调控PI3K/Akt/mTOR通路、TLR3/TLR9、miR-155、CD40-CD40L系统、miR-467b等miR及其下游信号有关。

鉴于miR-17-5p能够靶向调控VLDLR或靶向调控PCSK9间接调控VLDLR，抑制血管炎症反应，减轻VSMC损伤，防治AS，本研究旨在验证血管软化丸抗AS的作用机制是否与靶向调控miR-17-5p，靶向调控VLDLR或靶向调控PCSK9间接调控VLDLR，抑制血管炎症反应，减轻VSMC损伤有关，进而揭示血管软化丸防治AS的分子机制，这是本研究的思路创新。

本研究结果显示，经过血清干预后，与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组和两个中药含药血清组VSMC活性均明显升高，VSMC中miR-17-5p、VLDLR mRNA表达水平均明显降低，VSMC中PCSK9 mRNA和蛋白表达水平均明显升高；与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组和两个中药含药血清组细胞VLDLR蛋白表达水平均明显降低。这表明VSMC活性与miR-17-5p和VLDLR mRNA表达水平呈负相关，与PCSK9 mRNA表达水平呈正相关，血管软化丸对Ox-LDL构建平滑肌细胞损伤模型的VLDLR和PCSK9表达有明显调控作用，这可能与调控miR-17-5p表达有关。

体内实验结果也显示，经过干预后，与模型组比较，miR-17-5p抑制剂组和血管软化丸高、低剂量组外周血清中IL-6和TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高，miR-17-5p抑制剂组和血管软化丸高、低剂量组主动脉miR-17-5p和VLDLR mRNA表达水平均明显降低，PCSK9 mRNA表达水平明显升高；血管软化丸不同剂量组之间各项指标比较差异无统计学意义，不存在量效关系。病理学检测也证实，血管软化丸和miR-17-5p抑制剂均能防治AS。

综上所述，血管软化丸防治AS的作用机制可能与靶向调控miR-17-5p，靶向调控VLDLR或靶向调控PCSK9间接调控VLDLR，抑制血管炎症反应，减轻VSMC损伤有关。