循阳明经按摩对脑卒中大鼠神经功能的影响及其机制

赵金菊，石国凤，谢蕴慧，温丹果

(贵州中医药大学护理学院，贵州 贵阳 550025)

脑卒中是中国成年人群致死、致残的首位病因。脑卒中后神经功能缺损导致患者肢体运动功能障碍、感觉障碍等，影响着患者的生活质量，给患者本人、家庭及社会带来沉重的负担。研究证实，早期正规介入功能康复训练，可以促进脑梗死后神经功能恢复，改善其神经运动功能，提高患者的生活质量。其中循经按摩疗法具有较好的临床疗效，但对脑梗死的作用机制仍不十分清楚。本研究对中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠偏瘫侧后肢循足阳明经进行按摩，观察循经按摩对脑卒中大鼠模型血清脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表达及脑组织超微结构的影响，为循经按摩治疗脑卒中神经功能障碍提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 清洁级健康SD大鼠80只，购于长沙市天勤生物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0011]，体质量为200～250 g，饲养于22 ℃环境下，12/12 h黑白交替，自由饮水摄食。适应性喂养1周。实验严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》及实验动物的伦理原则进行。

1.2 主要试剂 苏木素染色液(批号 1113A18)：雷根生物；伊红染色液(批号 C0109)、山羊血清(批号 C0265)、红细胞裂解液(批号 C3702)：碧云天；RNAiso Plus (批号 9108)：Takara；GoldenstarRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2(批号 TSK302M)、2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)(批号 TSE002)：擎科；大鼠BDNF：慧嘉生物科技。

1.3 主要仪器 倒置显微镜(CKK53)：OLYMPUS；透射电子显微镜(JEM-1400 Plus、组织处理机(EM TP)：徕卡；微量紫外-可见光分光光度计(NanoDrop One/One C)：Thermo；PCR仪(T100)、水平电泳槽( Mini-Sub Cell GT)、核酸蛋白凝胶成像仪及CCD(Universal Hood Ⅱ)：Bio-Rad；实时荧光定量PCR仪(7500)：Thermo。

2 方法

2.1 模型复制方法及分组 采用10%水合氯醛以350 mg/kg的剂量腹膜内注射麻醉大鼠。参照Longa等方法阻塞右大脑中动脉。分离右颈总动脉，右颈内动脉和右颈外动脉，结扎右颈外动脉和右颈内动脉。在靠近右颈总动脉的右颈外动脉上做一个小切口，并用线栓缓慢插入约18 mm的深度以造成大鼠MCAO。阻断供血2 h后，将线栓略微退回以允许再灌注2 h。对于假手术组，分开右颈外动脉、右颈总动脉和右颈总动脉但不作结扎。将大鼠随机分为假手术组、模型组、循经按摩组，每组24只。

2.2 干预方法 循经按摩组大鼠在模型复制24 h后给予循经按摩，用自制按摩仪，力量0.245～0.490 N、振动频率2 Hz，循足阳明经的走向，按摩模型大鼠偏瘫侧后肢，持续治疗10 min。循经按摩仪按摩后配合小按摩棒用点推法，循足阳明经推揉穴位：髀关、太冲、丰隆、足三里穴，重点推揉腓肠肌和大腿后部，以肢体微热、大鼠能承受为度，持续10 min。上述操作每天进行2次。3天组、7天组、14天组、21天组分别干预3、7、14、21 d后取材。模型组及假手术组不给予任何干预。

2.3 观察指标

2.3.1 神经功能评估 术后24 h参照Longa评分标准进行神经功能评分，评分为1～3分的大鼠被随机分配以用于随后的实验。分别于干预后3、7、14、21 d进行再次评估。

2.3.2 光学显微镜下观察脑组织细胞结构 所有洗涤样品均用4%多聚甲醛固定，将这些组织进行脱水处理、透明处理。透明处理后，制成厚度为5 μm的石蜡切片，平放在防坠玻璃上，并放置在55 ℃的烘焙机中，以确保组织块紧密地附着在玻片上，将切片进行脱蜡。所有样品每个步骤后均用蒸馏水洗涤2 min，共3次。采用苏木精染色10 min，在1%的盐酸中，用乙醇脱色细胞质中过量的苏木精染色液，伊红染色持续30 s。用95%乙醇脱水2次，每次2 min。然后用二甲苯玻璃化两次，每次5 min。最后采用中性树脂进行封片。

2.3.3 透射电子显微镜观察脑组织细胞结构 样品先用3%戊二醛预混，再用1%四氧化锇预混，然后用丙酮有序地脱水。用脱水剂和环氧树脂分别以3∶1、1∶1和1∶3的比例进行渗透。每步持续30～60 min。将浸润的样品块放置在适当的模具中，填充嵌入溶液，并嵌入到固体基体(嵌入块)中进行加热和聚合。用超薄切片机制备约50 nm厚的超薄切片，可在槽内液体表面漂浮，转移到铜网上，先用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染色，室温下放置15～20 min，用透射电子显微镜观察。

2.3.4 实时定量PCR检测BDNF mRNA表达水平 在最后一次干预后，采用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔内注射深度麻醉大鼠，从腹主动脉取血2 mL，提取总RNA，将获得的总RNA保存于-80 ℃冰箱。分别取2 μL RNA提取物加入到微量分光光度计中，分别测定230、260、280 nm的吸收峰值和比值，计算各样本中RNA的浓度和纯度。按反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，随后按照扩增试剂盒进行PCR扩增。BDNF上游引物：F-GTCCACGGACAAGGCAACT；下游引物：R-CAGCAGCTCTTCGATCACG。GAPDH上游引物：F-GCAAGTTCAACGGCACAG；下游引物：R-GCCAGTAGACTCCACGACATA。使用GAPDH作为内部对照计算BDNF mRNA的相对表达水平，使用2-ΔΔ法对结果进行定量。

2.3.5 采用酶联免疫吸附法测定BDNF蛋白表达水平 取大鼠全血，离心后取血清，置于-80 ℃冰箱，备用，使用时置于冰面解冻。准备工作浓度标准品及样品。加入检测缓冲液、工作浓度标准品及样品。加入检测血清，使用封板膜封板，室温孵育。加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，使用新的封板膜封板，室温孵育45 min。加入显色底物TMB，避光，室温孵育10～30 min。加入终止液，颜色由蓝色变成黄色。采用酶标仪测量各孔光密度(optical density,OD)值。根据样品的OD值，由标准曲线计算出浓度。将终止后的反应物置于酶标仪下检测，在450 nm处读取结果，以pg/mg的形式显示。

3 结果

3.1 各组MCAO大鼠神经功能评分比较 MCAO模型复制后，与假手术组比较，模型组、循经按摩组大鼠各时间点神经功能评分均明显提高(

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05)；与模型组比较，循经按摩组大鼠各个时间点神经功能评分均降低(

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05)。见表1。

表1 各组MCAO大鼠神经功能评分比较

3.2 各组大鼠皮质层、海马层神经细胞形态和结构观察 皮质层苏木精-伊红染色结果显示，假手术组皮质层神经细胞排列整齐、结构完整。模型组损伤部位未见明显的超时变化，神经细胞水肿随着核周间隙的增加而受到严重影响，部分间质也出现炎症细胞浸润。与模型组相比，循经按摩组损伤部位神经细胞水肿的变性随时间的推移而明显减轻。苏木精-伊红染色结果显示，假手术组海马层神经细胞结构完整、核仁清晰。模型组海马层神经细胞呈散射分布，细胞核固缩，并在间质中观察到水肿。与模型组海马层相比，循经按摩组神经细胞排列逐渐规律，且随着时间的推移排列逐渐紧密。见图1。

图1 各组大鼠皮质层、海马层细胞形态和结果观察(苏木精-伊红染色，10×20倍)

3.3 透射电子显微镜下各组大鼠脑组织神经细胞变化 假手术组大鼠脑组织神经细胞核呈圆形，染色质分布均匀，核膜清晰完整，细胞质富含完整清晰的核糖体、髓鞘、微丝、线粒体，其中神经髓鞘相对致密。模型组大鼠脑组织神经细胞具有凋亡细胞的特点：脑样本模糊，部分坏死神经细胞结构松散，细胞膜破裂，细胞质中大量线粒体肿胀，消失形成液泡的皱褶，染色质聚集，核膜完整但细胞体积收缩，髓鞘神经纤维变性和明显的自噬。循经按摩组大鼠脑组织神经细胞核圆，染色质分布均匀，核膜清晰完整，细胞质中有线粒体、粗面内质网和核糖体。与模型组相比，循经按摩组大鼠脑组织神经细胞肿胀、自噬和凋亡明显减少。见图2。

注：黄色箭头表示凋亡细胞；红色箭头表示肿胀的线粒体；绿色箭头表示胞浆内空泡；蓝色箭头表示自噬

3.4 各组大鼠BDNF mRNA及蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组各个时间点大鼠BDNF mRNA及蛋白表达水平均明显下调(

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05)；与模型组比较，循经按摩组各个时间点大鼠BDNF mRNA及蛋白表达水平均明显上调(

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05)。见表2。

表2 各组大鼠BDNF mRNA及蛋白表达水平比较

4 讨论

脑卒中已成为中国成年人死亡和致残的主要原因，属于中医“中风”范畴，其中，缺血性脑卒中是其主要类型。脑缺血后脑组织炎症反应是神经损伤的重要原因，炎症反应导致神经细胞大量凋亡，凋亡后的神经细胞会失去原有功能，并且能阻断细胞间的信号连接，进而加重脑卒中患者的神经功能障碍。脑缺血发生时，经MRI检测发现海马神经细胞的结构、数目及功能发生异常变化，导致神经组织、细胞受损，出现萎缩甚至自噬，导致神经再生障碍，严重影响着脑卒中后患者神经功能的恢复。

BDNF是一种神经营养因子，在中枢神经系统神经发生、神经保护和轴突导向中具有多种作用，与神经细胞损伤后再生修复密切相关。BDNF通过附着到Tropomyosin受体激酶B受体上，触发下游信号传导途径，参与细胞的生长、增殖和神经重塑。有报道显示，BDNF的大量分泌，能促进神经功能的恢复，改善神经细胞的微环境，使神经损伤得以修复。临床研究结果显示，提高脑梗死患者BDNF的表达，可以促进其神经功能的恢复。

研究表明，针灸、艾灸作用于穴位，能改善大脑氧代谢，促进脑侧支循环的建立，增加脑血流量，具有神经保护作用，不仅能减少脑神经细胞的凋亡，而且能促进受损脑血管和中枢神经细胞的修复，重建受损的血脑屏障，维持其正常功能，减少梗死体积，并达到治疗的作用。研究显示，针灸、艾灸可以提高BDNF表达水平。

足阳明胃经是五脏六腑之海，是气血生化之源。研究证明，刺激足阳明胃经产生的信号可传入脑，影响脑神经的功能。阳明为气血津液生化之源，主润宗筋，阳明经对肌肉、筋骨具有重要的作用。《素问·痿论》中也记载“治痿独取阳明”，阳明经是治疗痿证的重要经络。

本研究对脑卒中大鼠模型进行循足阳明经按摩，通过Longa评分评价各组大鼠神经功能评分。结果发现，循经按摩可以改善大鼠神经功能。通过PCR、ELISA检测大鼠的全血BDNF mRNA及其蛋白表达水平，发现循经按摩组大鼠BDNF mRNA及其蛋白表达水平明显高于模型组。采用苏木精-伊红染色法观察了大鼠的脑组织，发现循经按摩可以恢复大鼠神经细胞的形态和结构。通过透射电子显微镜发现，循经按摩组大鼠脑组织神经细胞损伤、细胞凋亡和自噬较模型组减轻，表明循经按摩可以减少脑卒中大鼠脑组织神经细胞的损伤，修复神经细胞。推测其原因可能是循经按摩提高了BDNF的表达水平，进而促进神经细胞结构及功能的修复，改善神经功能。这与荆莉的研究具有一致性。

本研究结果表明，循经按摩能提高大鼠BDNF的表达水平，减轻脑组织神经细胞的凋亡，为循经按摩在临床中的应用提供了理论依据，但发挥作用的机制尚未完全清楚，这将是下一步研究的目标。