芙蓉膏对家兔皮肤软组织感染的抑菌抗炎作用
2021-12-21高家荣于庆生
薛 雪，高家荣，于庆生，张 琦
(安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)
芙蓉膏是安徽省名老中医汤琢成研制的外用膏剂经验方，是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，以木芙蓉叶为主药，配以藤黄、生天南星、冰片、薄荷油等，经特殊工艺调制而成。芙蓉膏临床应用广泛，对感染性疾病如皮肤软组织化脓性感染、阑尾周围脓肿、早期褥疮，以及非感染性炎症类疾病都具有显著的疗效。目前，尚未见关于芙蓉膏对体表软组织感染抑菌抗炎作用的规范性实验研究。本研究以家兔为研究对象，探讨芙蓉膏对体表软组织感染的抑菌抗炎作用及其机制。
1 材料
1.1 菌株 金黄色葡萄球菌菌株(ATCC 29213)和大肠埃希菌菌株(ATCC 25922)均由安徽中医药大学第一附属医院检验科微生物室提供。
1.2 动物 选取健康清洁级新西兰家兔50只，月龄3个月，雌雄各半，体质量(2.0±0.5)kg，由安徽省实验动物中心提供，生产许可证编号为SCXK(皖)2018-006。饲养条件：室温(20～25)℃和相对湿度(55%～65%)适宜，保持空气流通，正常光照，动物自由饮水及进食，饮用水为净化水，垫料定期更换。
1.3 药物与试剂 青霉素纸片、芙蓉膏(成品前粉剂灭菌备用)由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，批号为皖药制Z20050068；复方黄柏液涂剂，由山东汉方制药有限公司生产，每瓶100 mL；莫匹罗星软膏，由中美天津史克制药有限公司生产，每支10 g，国药准字号为H10930064；硫化钠，由安徽中医药大学动物中心提供。兔肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)试剂盒(货号：CK-E80109R)、兔白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)试剂盒(CK-E80171R)、兔超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)试剂盒(货号：CK-E80045R)均由上海源叶生物科技有限公司提供。
1.4 仪器 MH琼脂平板：郑州安图生物工程股份有限公司；Densichek plus比浊仪：上海起发实验试剂有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温箱：上海三发科学仪器有限公司；XW-80A旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；标准灭菌滤纸片(直径6 mm，厚0.1 mm)：安徽中医药大学第一附属医院检验科微生物室；RM2145型切片机：德国Leica公司生产；DNM-9602G型酶标仪：北京普朗新技术有限公司；Olympus CX31型光学显微镜：日本Olympus公司；JW3021HR型离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司。
2 方法
2.1 抑菌实验
2.1.1 分组、干预方法及检测指标 分实验组(浓度为0.3 g/mL芙蓉膏粉剂溶液)、复方黄柏涂剂组、青霉素组。采用纸片琼脂扩散法进行抑菌实验。肉眼观察3种药物对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌菌株的生长是否具有抑制作用，如具有抑制作用，用毫米刻度尺测量各组抑菌环并记录。
2.1.2 检测方法 在无菌试管中将灭菌芙蓉膏粉剂与灭菌水按1∶3的比例混匀，标明为芙蓉膏粉剂溶液后取3个样本，分别涂于血培养皿中(37 ℃恒温箱中培养)，培养7 d无细菌生长者判断为无菌；将12片直径6 mm、厚0.1 mm的标准滤纸片随机平均分成两组，分别浸于芙蓉膏粉剂溶液和复方黄柏液涂剂中，制成药片。严格按照细菌培养要求进行细菌悬液配制：金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌分别接种于普通固体琼脂平板培养基(24 h)，然后用接种环再挑单一菌落置于无菌试管的灭菌水中，用Densichek plus比浊仪配制浓度为1.5×10/mL的标准菌株的金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌菌液；用灭菌棉签涂布浓度为1.5×10/mL的标准菌株菌液3遍于MH琼脂平板表面；MH琼脂平皿上均放入含有3组药液的药片，然后置于37 ℃孵育箱中孵育16 h，测量抑菌环直径，每组测量3次，最后取平均值。
2.2 抗炎实验
2.2.1 动物的分组、模型复制、干预方法 参照李仪奎的方法复制软组织感染模型。在新西兰家兔后背部直径5 cm的范围内先剪毛再脱毛，脱毛采用6%硫化钠，20%乌拉坦按3～4 mL/kg的剂量于24 h后经耳缘静脉注射给药，麻醉满意后取脱毛区直径4 cm区域为无菌操作范围，皮下注射金黄色葡萄球菌0.5 mL(1.5×10CFU/mL)，12 h后出现红、肿、热、痛为模型复制成功。用随机数字表法将50只新西兰家兔分为5组(每组10只)，分别为空白组，模型组，莫匹罗星组，芙蓉膏高、低剂量组。空白组、模型组采用生理盐水外涂脱毛处，每次涂擦约5 mL，莫匹罗星组、芙蓉膏高剂量组每次涂药物厚度5 mm，芙蓉膏低剂量组涂药物厚度3 mm，每日1次。每次换药后用纱布包好，连续用药7 d，单笼单只饲养。
2.2.2 观察指标及检测方法
(1)脱毛区组织形态学变化 用灭菌组织剪将家兔背部脱毛区剪下半径约4 cm的皮下病变组织固定于10%中性甲醛溶液中，经过乙醇序列脱干水分后，用石蜡包埋，切成薄片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光学显微镜下观察脱毛区组织病理变化(主要包括脓肿大小、炎症反应、成纤维细胞数量及纤维组织增生情况)。
(2)全血白细胞(white blood cell, WBC)、中性粒细胞(neutrophil, NE)数量检测 将家兔放置兔架上固定，沿家兔耳缘静脉采集1.5 mL血液，放入含有EDTA抗凝剂的采血管中，采用血细胞分析仪检测用药后第2、4、7天各组家兔全血中WBC、NE数量。
(3)血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平检测 在用药后第2、4、7天应用ELISA法检测各组家兔血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，具体操作按测试盒说明书进行。
3 结果
3.1 抑菌实验结果 芙蓉膏粉剂溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径为2.5 mm(n
=3)，对大肠埃希菌无明显抑制作用；复方黄柏涂剂对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌均无明显抑制作用；青霉素纸片对金黄色葡萄球菌的抑菌环为6 mm(n
=3)，对大肠埃希菌无明显抑制作用。3.2 各组大鼠后背脱毛区软组织形态学变化比较 正常组大鼠后背脱毛区软组织内无炎症细胞浸润；模型组大鼠后背脱毛区软组织有脓肿形成，伴大量炎症细胞浸润；莫匹罗星组大鼠后背脱毛区软组织内有少量炎症细胞浸润；芙蓉膏高剂量组大鼠后背脱毛区软组织内炎症明显减轻，脓肿缩小，少量炎症细胞浸润，亦可见纤维组织增生及少量新生毛细血管；芙蓉膏低剂量组大鼠后背脱毛区软组织脓肿缩小，部分炎症细胞浸润，亦可见纤维组织增生。见图1。
图1 各组家兔后背脱毛区软组织的形态学变化(HE染色，10×40倍)
3.3 各组大鼠全血WBC、NE计数比较 随着治疗时间延长，模型组和莫匹罗星组，芙蓉膏低、高剂量组大鼠全血中WBC、NE计数较前一时点显著降低(P
<0.
05)。与正常组比较，模型组家兔3个时点全血中WBC、NE均显著高于正常组(P
<0.
05)。与模型组比较，莫匹罗星组，芙蓉膏低、高剂量组家兔3个时点全血中WBC、NE计数均显著降低(P
<0.
05)或呈降低趋势(P
>0.
05)。芙蓉膏高剂量组大鼠3个时点全血中WBC计数显著低于芙蓉膏低剂量组(P
<0.
05)。见表1。
表1 各组家兔外周血WBC、NE计数比较
3.4 各组大鼠血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平比较 随着治疗时间延长，模型组和莫匹罗星组，芙蓉膏低、高剂量组大鼠血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6水平较前一时点显著降低(P
<0.
05)或呈降低趋势(P
>0.
05)。与正常组比较，治疗第2、4、7天模型组家兔血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平显著高于正常组(P
<0.
05)。与模型组比较，莫匹罗星组，芙蓉膏低、高剂量组3个时点血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均显著降低(P
<0.
05)或呈降低趋势(P
>0.
05)。治疗第7天，芙蓉膏高剂量组家兔血清TNF-α、IL-6水平显著低于芙蓉膏低剂量组(P
<0.
05)。见表2。
表2 各组家兔血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6水平比较
4 讨论
体表软组织感染是指各种化脓性病原菌侵犯表皮、真皮、皮下组织引起的炎症性疾病，通常为细菌感染，主要表现为病变部位的红、肿、热、痛等。体表软组织感染属中医“疮疡”范畴，多为火热之毒所致。西医治疗多采用抗生素、鱼石脂软膏等，临床效果有限。中医药在治疗体表软组织感染方面发挥了重要的作用。芙蓉膏临床用于治疗体表软组织感染已有40余年，疗效显著。芙蓉膏组方中的木芙蓉叶功能清热凉血、消肿止痛。《本草纲目·木部·芙蓉》记载木芙蓉叶外用主治痈疽肿毒、一切疮肿。实验研究也表明木芙蓉叶提取物有抑菌活性。藤黄能消肿、攻毒、祛腐敛疮，药理研究认为其有效成分藤黄酸具有抑制炎症、抗细菌的作用。生天南星功能散结消肿，外治痈肿。研究发现天南星抗炎和镇痛效果显著。《新修本草》中记载冰片有清热止痛之功效，现代研究表明其抗炎作用确切，具有良好的透皮吸收作用。薄荷油消炎止痒，外用可使皮肤或黏膜产生清凉感。本研究分别从抑菌实验与抗炎实验角度，证实芙蓉膏对体表软组织感染的抑菌抗炎作用。
抑菌实验结果显示，芙蓉膏粉剂溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌环为2.5 mm，其抑菌作用显著，这也是其促进软组织感染修复的原因。组织形态学观察发现，芙蓉膏高剂量组仅有少量炎症细胞浸润，脓肿缩小，芙蓉膏低剂量组亦有部分炎症细胞浸润，说明不同剂量芙蓉膏对细菌所致兔软组织感染均有治疗作用，高剂量芙蓉膏更加显著。WBC和NE是细菌性感染的常用指标，临床应用价值较高。本实验结果显示，不同剂量的芙蓉膏均可降低模型家兔血WBC、NE计数，高剂量组降低更加显著(P
<0.
05)。hs-CRP、IL-6、TNF-α均属于机体炎症标志物，含量越高代表感染越严重。hs-CRP是急性时相反应蛋白，由肝细胞分泌，是细菌性感染评估指标之一。TNF-α可介导炎症反应，能增强WBC对内皮细胞的粘附，促进炎症发生。IL-6可放大和催化炎症反应，增强TNF-α的效应。本实验结果显示，不同剂量芙蓉膏均能够降低血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，说明外用芙蓉膏可经皮吸收进入血液循环，直达炎症组织，抑制炎症反应，从而影响全身性炎症指标的变化。与芙蓉膏低剂量组比较，高剂量组hs-CRP、TNF-α、IL-6水平降低更加显著，进一步说明高剂量组治疗效果优于低剂量组。本实验研究表明，芙蓉膏对金黄色葡萄球菌生长有抑制作用，可减轻家兔后背感染软组织的炎症反应，促进创面修复，高剂量效果更优。其作用机制可能与降低血WBC、NE计数，调节促炎因子TNF-α、IL-6水平有关。
