肝豆汤改良方调控PKR/eIF2α通路改善Wilson病模型TX小鼠突触功能障碍的机制研究

刘松杨，程 楠，徐陈陈，董健健，高曼莉

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是由ATP7B基因突变引起以铜代谢障碍为表现的神经性遗传病。部分WD患者，特别是脑型患者伴有较明显的认知功能障碍，临床主要表现为记忆力减退、学习能力下降等。安徽中医药大学神经病学研究所自1970年代开始使用具有清热解毒、通腑利湿作用的肝豆汤治疗WD患者获得显著临床疗效。肝豆汤改良方是在原肝豆汤组方基础上加芍药、山茱萸、三七等活血养髓药物组成，该改良方可改善脑损伤与肝损伤WD患者的认知功能。实验研究发现，肝豆汤改良方可通过调控细胞色素C(cytochrome-C, Cyt-C)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease, Caspase)信号通路达到减轻高铜诱导的海马神经细胞损伤。双链RNA依赖蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)作为一种泛素化蛋白激酶参与多种生理病理过程。铜沉积于脑中可引起氧化应激，激活PKR，激活后的PKR会进一步促使真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，促进细胞凋亡和抑制突触相关蛋白的表达，导致突触功能障碍。而突触功能障碍是多数神经退行性疾病及认知功能障碍性疾病的致病机制之一。研究证实，高铜可通过激活PKR/eIF2α通路诱导神经细胞凋亡,抑制突触相关蛋白表达，损伤突触功能，降低小鼠的认知功能。高铜诱导的突触功能障碍，可能是脑型WD患者出现认知功能损伤的重要机制，而肝豆汤改良方通过抑制PKR/eIF2α通路减轻高铜诱导的突触功能障碍，改善WD患者认知功能。本实验以毒牛奶(toxic milk，TX)小鼠为研究对象，基于PKR/eIF2α通路探究肝豆汤改良方改善高铜诱导的突触功能障碍的作用靶点，旨在为肝豆汤改良方治疗脑型WD患者认知功能障碍提供分子学实验依据，为临床中医药治疗提供新的治疗思路。

1 材料

1.1 动物 TX种鼠从美国Jackson动物实验室中心引进，在中国科学院合肥物质研究院SPF级实验动物中心饲养并传代繁殖。动物由专人负责，环境温度保持22～26 ℃，12 h光照，常规鼠类饲料喂养，自由饮水。TX小鼠是淡化致死基因(dilute lethal,DL)小鼠的自然突变品系，是理想的WD动物模型。本次实验选择DL和TX小鼠各40只，每只小鼠体质量为20～25 g。模型动物在入组前均进行基因检测以确定种鼠及其子代的遗传具有WD模型的特性。实验动物使用许可证号：SYXK(皖)2018-005。

1.2 药物及试剂 肝豆汤改良方：大黄、黄连、莪术、姜黄、芍药各20 g，鱼腥草、山茱萸各30 g，泽泻24 g，三七3 g。药物均购自北京同仁堂药店安徽合肥分店，均符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。加入蒸馏水200 mL，浸泡30 min，大火煮沸后加入大黄，再以文火煎30 min，过滤至烧杯中，药渣再加入蒸馏水200 mL，重复煎煮过滤。最后把2次药液合并，文火浓缩至150 mL(含生药2.2 g/mL)，冷却后倒入棕色瓶内，并于4 ℃冰箱保存备用。Western及RIPA组织/细胞裂解液(R0020)：北京索莱宝科技有限公司；抗eIF2α抗体(ab5324)、抗p-eIF2α抗体(ab3398)、抗转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)抗体(ab3398)、抗促凋亡分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)抗体(ab5554)、抗突触蛋白1(synapsin1)抗体(ab5297)、抗突触素(synaptophysin)抗体(ab36406)、抗突触后致密物-93(postsynaptic density-93，PSD-93)抗体(ab19046)、抗突触后致密物-95(postsynaptic density-95，PSD-95)抗体(ab3450)：CST公司；抗PKR抗体(ab184257)：英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗(ZB-2301)：北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.3 仪器 Fine DO X6型全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司；TGL-16型台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司；PowerPac Basic型蛋白电泳仪及转膜仪：美国伯乐公司；Dura 12FV实验室超纯水系统：美国The-Lab Corporation-泽拉布仪器科技有限公司。

2 方法

2.1 分组及给药方法 正常组、正常加肝豆汤改良方组(DL小鼠各20只)，模型组、模型加肝豆汤改良方组(TX小鼠各20只)。正常组与模型组每日分2次予生理盐水各20 mL/kg灌胃，连续4周；正常加肝豆汤改良方组与模型加肝豆汤改良方组每日分2次予中药肝豆汤改良方各20 mL/kg(相当于60 kg成人临床剂量的9倍)灌胃，连续4周。末次给药结束后，取各组小鼠海马组织进行检测。

2.2 行为学检测小鼠认知功能 分别从正常组、正常加肝豆汤改良方组、模型组、模型加肝豆汤改良方组中随机抽取6只进行行为学实验。

2.2.1 旷场实验 试验所需的装置为长、宽各50 cm，高40 cm区域，其底部分为3个区域，边缘区(1区)，中间区(2区)，中心区(3区)。1区距离旷场边缘8 cm，3区占总区域面积的16%，剩下为2区。在旷场中的同一位置，将所有实验小鼠面壁放入旷场中，记录小鼠在旷场中5 min内的自由活动情况。所有实验过程应用荷兰Noldus公司的Ethovision XT监测分析系统进行检测并分析。

2.2.2 Barnes迷宫 Barnes迷宫所需装置高99 cm，直径122 cm，有20个均匀分布的孔，距边缘2 cm。这些孔的直径10 cm、外观均匀，只有一个孔连接到黑色可移动的逃生盒。训练时，先将小鼠放在逃生盒30 s让其熟悉环境，30 s后将小鼠拿到平台并计时3 min观察小鼠运动轨迹与能否找到逃生盒。共训练4 d，每天2次，每次间隔30 min。在第5天进行测试，测试方法与训练相同。记录其找到目标洞口的潜伏期。

2.3 TUNEL染色法检测小鼠海马神经细胞损伤情况 取小鼠海马组织进行固定、石蜡包埋、组织切片。TUNEL染色：切片常规脱蜡、抗原修复、TUNEL反应液室温避光孵育、PBS漂洗、DAPI复染、PBS漂洗、封片。荧光显微镜下观察采集图像，TUNEL阳性表达呈绿色。采用Image J软件对图像进行定量分析。

2.4 免疫荧光检测小鼠海马8-羟化脱氧鸟苷(8-hydroxylated deoxyguanosine，8-OHdG)表达水平 取小鼠海马组织进行脱水、浸蜡、包埋、切片。切片用一抗孵育4 ℃过夜、二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗、DAPI细胞核染色。荧光显微镜下观察采集图像，8-OHdG阳性表达呈红色。Image J软件对图像进行定量分析。

2.5 Western blot检测海马PKR/eIF2α通路以及突触相关蛋白表达水平 取小鼠海马组织，通过BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。之后，将4倍蛋白上样缓冲液添加到蛋白质溶液中，并加热8 min以使蛋白质变性。制胶电泳转膜，将蛋白样本转移至NC膜上。膜用5%脱脂奶粉封闭4 h，TBST洗3次，每次10 min，一抗摇床4 ℃过夜。二抗摇床1.5 h，TBST洗3次，每次10 min。凝胶成像系统拍照，Image J软件对图像进行分析。

3 结果

3.1 肝豆汤改良方对WD模型TX小鼠认知功能的影响 旷场实验结果显示，模型组中央路程与中央时间显著低于正常组(

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05)，边上路程与边上时间显著高于正常组(

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05)；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组中央路程与中央时间显著增加(

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05)，边上路程与边上时间显著降低(

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05)。Barnes迷宫实验结果显示，模型组找到目标洞口的潜伏期显著高于正常组(

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05)；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组小鼠找到目标洞口的潜伏期显著降低(

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05)。见表1。

表1 各组小鼠行为学实验结果比较

3.2 肝豆汤改良方对WD模型TX小鼠海马神经细胞损伤的改善作用 与正常组比较，模型组海马神经细胞凋亡数目显著增加(

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05)；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组海马神经细胞凋亡数量显著降低(

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05)。见图1。

注：A.正常组；B.正常加肝豆汤改良方组；C.模型组；D.模型加肝豆汤改良方组；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 肝豆汤改良方对WD模型TX小鼠海马8-OHdG表达水平的影响 与正常组比较，模型组海马8-OHdG表达水平显著增加(

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05)；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组8-OHdG表达水平显著降低(

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05)。见图2。

注：A.正常组；B.正常加肝豆汤改良方组；C.模型组；D.模型加肝豆汤改良方组；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.4 肝豆汤改良方对Wilson病模型TX小鼠海马PKR/eIF2α通路及突触相关蛋白表达水平的影响 与正常组比较，模型组海马PSD-93、PSD-95、Synapsin-1、Synaptophysin蛋白表达水平均显著降低(

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05)；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组海马PSD-93、PSD-95、Synapsin-1、Synaptophysin蛋白表达水平均显著增加(

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05)。见图3。

注：A.正常组；B.正常加肝豆汤改良方组；C.模型组；D.模型加肝豆汤改良方组；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

与正常组比较，模型组海马PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平均显著增加(

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05)；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组海马PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平均显著降低(

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05)。见图4。

注：A.正常组；B.正常加肝豆汤改良方组；C.模型组；D.模型加肝豆汤改良方组；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

铜是人体必需的一种金属微量元素，对中枢神经系统功能的维持具有必不可少的作用。而环境或遗传因素所致的体内铜缺乏或沉积均会导致中枢神经系统损伤。近年来，人们逐步认识到部分神经退行性疾病与中枢神经系统铜稳态的失调控相关，如WD。

铜稳态失调与认知功能的关系已吸引更多研究者的注意。阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者脑中铜含量显著升高，其铜稳态的失衡可能导致AD患者认知缺陷和其病理的加重。动物实验研究发现，普通小鼠海马注射Cu-Aβ1-42，可出现认知障碍，经过铜螯合剂治疗之后，实验小鼠的认知功能显著改善；长期铜暴露不仅会加速AD小鼠认知功能下降，而且会使正常小鼠出现认知损伤。为了研究WD患者高铜水平对认知功能的影响，本实验选用TX小鼠为实验对象。本实验行为学结果显示，模型组小鼠的认知功能显著低于正常组；模型加肝豆汤改良方组小鼠的认知功能显著优于模型组。由此可见，中药肝豆汤改良方可改善TX小鼠的认知功能。

突触是神经细胞相接触部分的功能特化区，也是多种学习形式的基础，其功能紊乱可导致认知损害。Synaptophysin是一种特异性存在突触囊泡膜上的糖蛋白，反映突触分布与密度；Synapsin1是一种神经细胞特异的磷酸化蛋白，通过调节突触前囊泡释放和突触传递来影响其突触功能。作为兴奋性突触后密度的支架蛋白，PSD-93通过调节神经递质的释放，对突触可塑性尤其是在短时程突触可塑性的发生过程中起到关键作用；PSD-95在神经发育过程中涉及谷氨酸能传递，是突触可塑性和树突棘形态发生的重要组成部分。实验结果显示，与正常组比较，模型组海马区Synapsin1、Synaptophysin、PSD-93、PSD-95的蛋白表达量显著降低；与模型组比较，模型加肝豆汤改良方组海马区Synapsin1、Synaptophysin、PSD-93、PSD-95的蛋白表达水平显著增加。因此，本实验结果表明TX小鼠存在突触功能障碍，中药肝豆汤改良方可改善TX小鼠突触功能。

8-OHdG是氧化应激或者含氧代谢过程中产生的羟基自由基，是氧化应激损伤的标志物。本实验研究结果显示，模型组海马8-OHdG表达水平显著高于正常组；模型加肝豆汤改良方组8-OHdG表达水平显著低于模型组。这表明中药肝豆汤改良方可降低铜沉积所诱导的氧化应激损伤。

脑内铜沉积可诱导氧化应激，激活PKR/eIF2α通路。活化后的PKR可诱导真核eIF2α发生磷酸化，减少蛋白转运，p-eIF2α通过调控突触可塑性，进而损伤患者的记忆功能。增加的P-eIF2α可以选择性刺激ATF4的翻译，促进凋亡分子CHOP的表达增加，诱导细胞凋亡，从而抑制突触相关蛋白Synapsin1、 Synaptophysin、PSD-93、PSD-95表达，损伤突触功能。本实验结果显示，模型组PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平较正常组显著增加；模型加肝豆汤改良方组PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平较模型组显著下调。TUNEL染色结果显示，肝豆汤改良方可显著降低TX小鼠海马神经细胞凋亡。结果表明，高铜环境可激活PKR/eIF2α通路诱导突触功能，而肝豆汤改良方可通过抑制PKR/eIF2α通路减轻高铜诱导突触功能障碍，改善TX小鼠认知功能损伤。

综合以上实验结果，笔者认为，TX小鼠海马内PKR/eIF2α通路被激活，诱导突触功能障碍，损伤TX小鼠认知功能；中药肝豆汤改良方可通过调控PKR/eIF2α通路，促进突触相关蛋白表达，减轻高铜诱导的突触功能障碍，改善TX小鼠认知功能损伤症状。