白藜芦醇对急性肺损伤大鼠的抗炎作用研究

朱诗乒　楼雅芳　黄小芳　丁旭春　胡晶晶　邓浩然　蔡宛如

[摘要] [關键词] 急性肺损伤;大鼠;白藜芦醇;肿瘤坏死因子-α

[中图分类号] R331          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）27-0034-03

The anti-inflammatory effects study of resveratrol on acute lung injury rats

ZHU Shiping1   LOU Yafang1   HUANG Xiaofang1   DING Xuchun1   HU Jingjing1   DENG Haoran1   CAI Wanru2

1.Department of Respiratory Medicine，Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou ;  310007，China;2.Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou   310005，China

[Abstract] Objective To evaluate the protective efficacy of resveratrol，an effective component of polygonum cuspidatum，on acute lung injury through animal experiments. Methods A total of 40 SD rats were randomly divided into the blank group（n=10），the model group （n=10），the solvent control group （n=10） and the resveratrol treatment group （n=10）. The acute lung injury model was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide （LPS）. The solvent group was intraperitoneally injected with monomer dissolvent agent （fat emulsion），while the resveratrol treatment group was intraperitoneally injected with resveratrol and solubilizer. They were injected intraperitoneally 24 hours before，during and within 24 hours after the model was established. Samples were collected 48 hours after the model was established. Meanwhile，the lung tissues were examined by pathological staining，and the neutrophil ratio，tumor necrosis factor-α （TNF-α） and lactate dehydrogenase （LDH） contents in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected. Results The neutrophil ratio and TNF-α in BALF of resveratrol treatment group were （68.432±20.623），（92.644±11.322）ng/L，which were higher than those of （87.023±4.032），（106.654±4.606）ng/L in the solvent control group，with statistically significant differences （P<0.05）. There was no statistically significant difference in LDH values between the two groups of BALF（P>0.05）.  Conclusion Resveratrol treatment group can significantly reduce pulmonary interstitial inflammatory cell infiltration，pulmonary interstitial edema，bronchoalveolar wall thickening and bronchoalveolar cavity destruction degree. Resveratrol has certain anti-inflammatory efficacy on rats with acute lung injury.

[Key words] Acute lung injury; Rats; Resveratrol; Tumor necrosis factor-α

肺部炎症进展导致氧气交换功能障碍并引起严重低氧血症是急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）重要特征，其作为呼吸系统危急重症疾病，临床预后差，病死率居高不下[1]，防治本类疾病具有非常重要的临床意义。ALI的具体疾病机制尚未阐明，迄今为止缺乏有效的治疗药物和手段。天然药物存在一定的治疗前景，基于前期研究，已证明中药“虎杖”其复方中药制剂可抑制急性肺损伤大鼠肺部炎症反应，显示出一定的抗炎治疗作用[2-3]。但是，其具体单体及机制尚未阐明。白藜芦醇是虎杖的重要活性成分，也是其主要成分。在国外的相关试验证实白藜芦醇具有较强的抗炎活性，但是，其在急性肺损伤中的研究還不多见。因此，本研究通过SD大鼠的急性肺损伤模型评价白藜芦醇对肺炎炎症的保护作用，为进一步探讨其相关作用机制提供基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验对象

40只清洁级健康雄性SD大鼠（由浙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号：2011A033），体重为（200±20）g。本实验经过动物伦理委员会审批通过。

1.2试剂和药物

白藜芦醇（98%分析纯）;LPS;液态异氟烷;脂肪乳（250 mL∶50 g大豆油，3 g卵磷脂）;LDH测定试剂盒;TNF-α ELISA测定试剂盒;生理盐水等。

1.3 实验仪器

冰箱;孵育箱;大鼠灌胃器;电子天平称;烧杯;离心机;酶标仪;液态雾化吸入装置;移液枪;光学显微镜;自动包埋机;切片机;玻片等。

1.4模型建立

随机将40只SD大鼠分为4组，每组各10只，分别为空白对照组、肺损伤模型组、溶剂对照组和白藜芦醇治疗组。将肺损伤模型组、溶剂对照组和白藜芦醇治疗组大鼠进行急性肺损伤造模。方法如下：液态雾化装置雾化异氟烷并让大鼠吸入麻醉，除毛消毒后进行气管分离及切开;LPS溶液（配置1 mg/mL浓度）通过1 mL针筒缓慢注射入大鼠气管中（1.5 mg/kg剂量），将切口缝合消毒后并将大鼠轻轻摆动，使其能够在大鼠肺组织中均匀分布。空白对照组小鼠不进行造模。

1.5给药方法

将白藜芦醇溶解于脂肪乳剂中（配置1 mg/mL浓度），除了空白对照组外，其余各组大鼠均在造模前24 h、造模时以及造模后24 h 3个时间点进行腹腔内给药（剂量10 mg/kg）。

1.6 标本收集

在造模完成48 h后，麻醉大鼠并将大鼠进行解剖，暴露肺部收集标本：①肺部组织：取左上肺叶分剪成三段，进行HE染色;②肺泡灌洗液：结扎左上支气管，用生理盐水在右侧及左下肺行肺泡灌洗，将灌洗液摇匀并放入离心管中，低速离心后取上层清液，可保存于-80℃冰箱中。

1.7实验指标

1.7.1 病理检查  大鼠肺组织需要进行HE染色，显微镜观察其肺部组织病理改变。

1.7.2 BALF中性粒细胞比值、TNF-α及LDH  将肺泡灌洗洗液离心，用移液枪吸出细胞沉渣约1 mL并铺展于玻片上，风干后对细胞进行瑞氏染色，计算出中性粒细胞比值。采用酶联免疫法检测肺泡灌洗液中TNF-α含量;检测肺泡灌洗液中LDH含量。

1.8统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验;计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镜下观察HE染色

①空白对照组：肺泡结构完整，肺间质无炎症细胞浸润，肺泡壁无明显水肿及充血。②肺损伤模型组：肺泡腔结构出现破坏，肺泡相互融合，肺泡间隔增宽明显，肺间质见大量的炎症细胞（中性粒细胞、淋巴细胞等）浸润及出血，肺泡腔内可见少量炎症细胞（中性粒细胞、淋巴细胞等）浸润及出血，充血水肿明显。③溶剂对照组：与肺损伤模型组相比病理改变大致相同。④白藜芦醇治疗组：肺泡结构的破坏、肺泡壁炎症增厚及充血水肿、肺间质内炎症细胞的浸润及出血均较溶剂对照组有所减轻。见封三图6。

2.2各组大鼠BALF中性粒细胞数百分比、TNF-α及LDH含量比较

空白对照组BALF中性粒细胞数百分比、TNF-α及LDH含量最低，与肺损伤模型组相比，差异有统计学意义（P=0.002、0.002、0.001<0.01）;溶剂对照组中性粒细胞数百分比、TNF-α及LDH含量较肺损伤模型组无明显差异（P=0.679、0.569、0.382>0.05），提示溶剂对ALI无治疗作用。白藜芦醇治疗组中性粒细胞数百分比、TNF-α与溶剂对照组比较，差异有统计学意义（P=0.003、0.007<0.01）。白藜芦醇治疗组LDH与溶剂对照组比较，差异无统计学意义（P=0.256>0.05）。见表1。

3 讨论

在ALI发生发展过程中，炎症反应始终是重要的启动及发展因素，且需要各种炎症调控通路（如NF-κB通路等）的参与调控[4]。其中细菌感染引起的急性肺损伤在临床上最为多见[5]，LPS可以刺激气道上皮细胞、中性粒细胞及肺泡巨噬细胞[6]，使其过量产生趋化因子和炎症因子[7]，进而引起并发展成炎症因子瀑布，甚至引起死亡。其中，中性粒细胞是由LPS介导的急性炎症反应过程中最为重要的炎症细胞，是ALI发生炎症反应时最先被募集的细胞，其通过释放蛋白酶加重炎症反应，还可迁移到肺部进行脱颗粒进一步释放炎症介质（杀菌蛋白、细胞因子和活性氧）引起促炎反应。因此，其在肺泡中的含量能够反映肺组织的炎症程度[8]。当肺部炎症进一步加重时，活化的肺泡巨噬细胞释放TNF-α和IL-1β，使肺泡中其他细胞（如肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞等）产生趋化因子，激活炎症级联反应，导致炎症细胞不断迁移至肺部，扩大的炎症反应进一步损伤相关组织细胞，从而导致肺组织的进一步损害[9]。在促炎因子中，以TNF-α最为显著，是炎症反应中具有始动和关键性作用的促炎因子，其能聚集并激活中性粒细胞，引起肺泡细胞的溶解，促使更多炎症细胞在肺内募集迁移及血管内皮损伤，进而导致炎症因子爆发式释放从而加剧肺损伤。因此，其是急性肺损伤炎症反应过程中最为重要的标志物之一[10]。

另外，在LPS導致的ALI中，肺脏内聚集了大量中性粒细胞与巨噬细胞能够产生并释放大量氧自由基（Oxygen free radical，OFR），引起肺组织内氧化及抗氧化系统失去平衡[11]。大量的活性氧促发脂质过氧化，破坏细胞膜结构，引起血及肺组织中LDH含量增加[12]。因此肺组织中LDH含量可反映肺部炎症损伤时其氧化与抗氧化系统的失衡程度。

通过前期的基础实验研究发现，虎杖及其中药复方可以减轻动物模型的急性肺损伤引起的肺部炎症反应，具有一定的抗炎作用，但其具体中药活性单体及具体作用机制尚不十分明确[13]。国外的相关研究证明，白藜芦醇具有较强的抗氧化活性，能够清除自由基并对花生四烯酸代谢产生影响，从而使DNA免受损伤[14-15]，其是一种抑炎因子，相关研究证实其可直接抑制炎症反应[16]。国内有学者证实，其能抑制NF-κB信号转导通路而达到抗炎作用[17-18]，但其对于急性肺损伤的抗炎研究鲜见报道[19-20]。

本研究结果证实，白藜芦醇对急性肺损伤大鼠肺部的抗炎保护作用，在组织病理学上，白藜芦醇治疗组大鼠的肺间质内炎症细胞浸润、充血水肿、呼吸膜增厚、肺泡腔结构破坏程度等一系列病理改变得到改善。在细胞层面能够降低大鼠肺泡灌洗液中性粒细胞比值，在炎症因子层面，其能有效降低肺泡灌洗液中的TNF-α。以上数据均提示白藜芦醇在急性肺损伤大鼠中显示出一定抗炎保护作用。值得注意的是，本研究结果显示，白藜芦醇治疗组较溶剂对照组的肺泡灌洗液中的乳酸脱氢酶（LDH）虽有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），提示在急性肺损伤中，白藜芦醇对大鼠肺组织保护很可能与抗炎作用相关，而与其抗氧化作用是否有直接关系需要通过进一步大样本量实验研究证实。

综上所述，白藜芦醇对急性肺损伤具有抗炎保护作用，其具体机制可能与降低肺组织中TNF-α等重要的促炎因子相关，具体炎症通路需要进一步实验证实。

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（收稿日期：2020-10-28）