靶向沉默CCDC132表达对卵巢癌细胞SKOV3生长、迁移及侵袭能力的影响及其机制研究

张慧雅　徐玉红　卢琪芸　单江静　陈君霞

[关键词] 卵巢癌;CCDC132基因;细胞生长;Wnt/β-catenin信号通路

[中图分类号] R737.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）27-0009-04

Effect of targeted silencing of CCDC132 expression on the growth， migration， and invasion of ovarian cancer cell line SKOV3 and its mechanism

ZHANG Huiya   XU Yuhong   LU Qiyun   SHAN Jiangjing   CHEN Junxia

Department of Gynecology， Shaoxing People′s Hospital in Zhejiang Province， Shaoxing   312000， China

[Abstract] Objective To study the effect of targeted silencing of the CCDC132 gene by shRNA on the proliferation，migration， and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells and its mechanism. Methods Ovarian cancer SKOV3 cell line was cultured in vitro. CCDC132-siRNA and empty vector sequence were designed and transfected into ovarian cancer SKOV3 cells， which were the sh-CCDC132 group and the control group. The relative expression of CCDC132 in each group was detected by qRT-PCR. Cell proliferation was detected by CCK8 assay. Cell migration was detected by scratch assay. Cell invasion was detected by transwell assay， and Wnt/β-catenin pathway-related protein expression was detected by Western Blot. Results After transfection， the expression level of CCDC132 in the sh-CCDC132 group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）. The proliferation rate of the sh-CCDC132 group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）， the migration rate was decreased（P<0.01）， and the number of invasive cells was significantly decreased（P<0.01）. The expression of caspase 3 and Bax protein was significantly up-regulated （P<0.01）， while the expression levels of β-catenin （P<0.01）， Cyclin D1（P<0.01） and c-myc（P<0.05） protein were significantly decreased. Conclusion Silencing CCDC132 can inhibit the proliferation， migration， and invasion of SKOV3 cells，and the specific mechanism may be related to the Wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words] Ovarian cancer; CCDC132 gene; Cell growth; Wnt/β-catenin signaling pathway

卵巢癌是婦科三大恶性肿瘤之一，其死亡率位于首位[1]。因早期卵巢癌患者无明显临床症状及体征，缺乏特异性诊断方法，大多数患者初次确诊已为晚期，且初始治疗后复发率高，5年总生存率低，因而寻找有效治疗卵巢癌的方式具有重要意义。卷曲螺旋结构域蛋白（Coiled-coil domain-containing，CCDC）其蛋白序列中存在一个或多个卷曲螺旋结构域，与肿瘤的发生发展密切相关，如CCDC80、CCDC67、CCDC66等[2-4]。CCDC132是内质网相关回收蛋白（Endosome-associated recycling protein，EARP）的重要组成部分，通过调控内吞小体回收至内质网参与细胞自噬[5]，从而发挥其生物学功能，如胰腺癌、胃癌[6-7]。Wnt/β-catenin信号通路在参与调控细胞增殖分化、肿瘤增殖和凋亡等多种生理病理过程[8]。目前研究显示，多种基因、药物均可通过Wnt/β-catenin信号通路作用于卵巢癌细胞，并引起其凋亡[9-13]。目前关于CCDC132在卵巢癌细胞中的是否有异常表达及是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响卵巢癌细胞生物学行为的研究尚未见报道。本实验以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，探讨CCDC132影响卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的可能机制，为进一步阐明卵巢癌发生发展的分子机制及治疗提供新线索，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 主要材料

人卵巢癌细胞株SKOV3购自中国科学院上海生物细胞研究所;胎牛血清和McCoy′s 5A培养基购自美国Gibco公司;CCDC132-shRNA（5′-CCGGCCTCA-AGAAAGCCTCAGTGATCTCGAGATCACTGAGGCTT-TCTTGAGGTTTTT-3′）及阴性对照Ctrl-shRNA（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司提供;CCDC132、caspase-3、Bax、β-catenin、Cyclin D1、c-myc、GAPDH 鼠抗人单克隆抗体及二抗均购于美国Santa Cruz公司;Trizol购自上海普飞公司，CCK-8试剂盒购于美国MedChenExpress公司。Matrigel基质胶购自美国Corning公司，Transwell小室（8.0 μm孔径）购自美国Corning公司，cDNA合成试剂盒购自美国Promega公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海碧云天生物公司，PVDF膜购于美国Millipore公司，酶标仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad），实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche），DNA/RNA Calculator（上海Pharmacia Biotech），低温高速离心机（美国Sigma），倒置显微镜（日本Olympus），紫外分光光度计（美国PE），CO2细胞培养箱（美国Thermo）。

1.2 SKOV3细胞培养与慢病毒感染

SKOV3细胞以含10%胎牛血清的McCoy′s 5A培养基在5% CO2、37℃和湿度饱和的细胞培养箱中常规培养。将对数生长期的SKOV3细胞以每孔105个接种至6孔细胞板上后，置于细胞培养箱中常规培养。实验分为对照组（以Ctrl-shRNA慢病毒感染）和sh-CCDC132组（以CCDC132-shRNA慢病毒感染）。培养24 h后，根据实验分组分别向SKOV3细胞中加入Ctrl-shRNA和CCDC132-shRNA 慢病毒溶液2.50 μL（病毒滴度为8×108 TU/mL）和6.67 μL（病毒滴度为3×108 TU/mL）进行感染;感染24 h后，更换新鲜培养液继续培养;培养72 h后，在荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况以评价感染效果。待细胞感染效率超过70%且细胞生长状态良好时，即可进行后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR检测SKOV3细胞中CCDC 132 mRNA表达水平

采用Trizol法提取SKOV3细胞中的总RNA后，使用DNA/RNA Calculator检测RNA的浓度与纯度。将高质量的RNA按照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA;再以cDNA为模板，根据上海吉凯基因化学技术有限公司合成的PCR引物按照PCR反应条件（95℃预变性 5 min;95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，循环40次）上PCR仪进行扩增，以GAPDH为模板，采用2-ΔΔCt法计算SKOV3细胞中CCDC132 mRNA的表达水平。实验重复3次。其中，PCR引物序列如下：CCDC132上游：5′-CATCTGGGGATACGCTGTATG-3′，下游：5′-GTAGTTCACTGGCGGTTGAG-3′;GAPDH上游5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.4 Western Blot检测SKOV3细胞中目的蛋白的表达水平

向SKOV3细胞中加入RIPA裂解液抽提细胞总蛋白后，采用核酸蛋白分析仪检测总蛋白的浓度与纯度。将热变性后的蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳分离后，电转至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封膜2 h后，加入按照1：1000比例稀释的目的蛋白一抗抗体和GAPDH抗体;置于4℃条件下孵育24 h后，加入按照1∶1000～1∶2000比例稀释的相应二抗摇床孵育2 h。以ECL化学发光剂显影后，以GAPDH为内参，采用凝胶成像分析系统扫描分析SKOV3细胞中目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.5 CCK8法檢测SKOV3细胞生长情况

将感染后的sh-CCDC132组和对照组细胞以每孔1000个接种至96孔细胞板上，其中每组设置3个复孔;置于细胞培养箱中常规培养，待细胞贴壁后，每隔24 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内孵育2 h。酶标仪测定吸光度。实验设计5个复孔取平均值，并重复3次。

1.6 划痕实验

用marker笔在6孔板底部背面均匀划3条记号线，取对数生长期细胞，接种于6孔板中常规培养。待细胞融合至70%～80%，用200 μL无菌中号枪头比着直尺用力划线，使划痕与记号线垂直。用无菌PBS轻轻洗涤细胞3次，洗去划下的细胞。向6孔板中加入无血清培养基，于5% CO2，37°C恒温箱中常规培养。每隔12 h对同一位置细胞拍照。应用Image J软件测量不同时间点划痕内空白距离的大小，并用计算迁移距离，比较两组细胞迁移率的大小。重复实验3次。

1.7 Transwell实验

用50 mg/L Matrigel胶稀释液包被 Transwell 小室基底膜。取对数生长期细胞，常规消化饥饿12～24 h，取含1×106个/mL的细胞悬液（无血清）100 μL，吹打均匀，加入Transwell小室，向下室加含血清培养基继续培养550 μL。分别于16 h和24 h，擦去小室基底膜上层细胞，甲醛固定 20 min，4 g/L 结晶紫染色30 min，均选10个视野，于倒置相差显微镜下观察、计数并照相。实验重复3次，每次设置3个复孔取平均值。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism8软件进行数据分析与图表绘制。计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒感染卵巢癌SKOV3细胞结果

CDC132-shRNA和Ctrl-shRNA慢病毒感染卵巢癌SKOV3细胞72 h后，采用荧光显微镜观察感染效率。结果显示，sh-CCDC132组和对照组细胞中均有GFP表达，细胞感染效率在80%以上，且细胞状态良好。见封三图1。

2.2 慢病毒感染SKOV3细胞后CCDC132 mRNA和蛋白表达结果

与对照组（0.055±0.016）比较，sh-CCDC132组细胞中CCDC132基因在mRNA表达水平（0.932±0.243）受到显著抑制（P<0.01）;同时，CCDC132-shRNA慢病毒感染后SKOV3细胞中CCDC132基因在蛋白水平的表达水平明显减弱。见封三图2。

2.3 敲低CCDC132表达卵巢癌SKOV3细胞增殖能力的影响

CCK8法检测结果表明，转染24 h起，sh-CCDC 132组OD450值低于对照组（P<0.01），提示细胞增殖活性受到显著抑制。见表1。

2.4 敲低CCDC132表达抑制卵巢癌SKOV3细胞迁移

划痕实验结果显示，转染后24 h，sh-CCDC132组与对照组的迁移率分别为（0.445±0.056）%、（0.871±0.005）%，提示sh-CCDC132组细胞比对照组划痕愈合程度减缓（P<0.01）。见封三图3。

2.5 敲低CCDC132表达抑制卵巢癌SKOV3细胞侵袭

实验结果显示，与对照组（181.33±29.02）相比，sh-CCDC132组（73.33±18.14）细胞每高倍镜视野下观察到的侵袭细胞数显著减少（P<0.01）。见封三图4。

2.6 敲低CCDC132后SKOV3細胞中caspase-3、Bax、β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白的表达

Western Blot实验结果显示，与对照组相比，sh-CCDC132组细胞caspase-3、Bax蛋白表达明显上调，而β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白表达水平显著降低。见表2、封三图5。

3 讨论

CCDC132又名囊泡分拣蛋白50（Vacuolar protein sorting 50，VPS50），位于7号染色体q21.2～q21.3，全长1216 bp，编码964个氨基酸，全蛋白分子质量为111.2 kDa[5]。cBioPortal数据库（http：//www.cbioportal.org/）显示CCDC132在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、肾上腺皮质癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、肺腺癌、卵巢浆液性囊腺癌和胃癌中存在异常表达。目前对CCDC132的功能的研究仍较少。现有的研究证实，CCDC132的异常表达与IgA肾病相关[14];CCDC132在特应性皮炎T细胞中呈高表达，可能参与特应性皮炎的过程[15];CCDC132也在神经元中表达，并控制囊泡酸化和突触功能，其功能突变可导致神经发育障碍[16];此外胰腺恶性肿瘤的导管液中CCDC132的表达增加，提示其可能在胰腺癌发生发展中起重要作用[6]。Xu等[7]研究报道，CCDC132在胃癌组织中呈高表达，而敲低其表达可通过增加CHK2磷酸化和p53蛋白表达等抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生发展、转移等过程中发挥着关键作用。Wnt信号激活后可抑制β-catenin磷酸化，激活Bax、Survivin、Cyclin D1等下游基因的表达[8，17-18]。Wnt/β-catenin信号通路广泛作用于多种恶性肿瘤，并参与细胞凋亡的调控，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等[11，19-22]。大量研究证实，多种基因可调控Wnt/β-catenin信号通路，如过表达miRNA-15a、miRNA-27a可抑制Wnt/β-catenin信号通路中Wnt3a、β-catenin等表达，抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭[9-10];靶向沉默LOXL2基因可抑制β-catenin、Cyclin D1表达，诱导卵巢癌细胞凋亡[11];CXCR4基因沉默后可抑制CTNNB1、c-myc等基因表达，调控卵巢癌细胞的转移[12];TRIM21过表达可抑制PARP抑制剂尼拉帕尼的抗癌活性，该作用可通过下调β-catenin或使用Wnt/β-catenin抑制剂XAV-939逆转[13]，提示该信号通路可能与卵巢癌靶向药物耐药相关。

本研究以CCDC132-shRNA慢病毒成功感染卵巢癌SKOV3细胞后发现，CCDC132基因表达水平明显降低，SKOV3细胞生长及迁移能力明显受到抑制。本研究还发现敲低CCDC132表达后，SKOV3细胞caspase-3、Bax蛋白表达增加，而β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白表达下调，提示CCDC132基因可能通过Wnt/β-catenin信号通路有关，CCDC132基因联合Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白检测可为卵巢癌诊断、靶向药物选择及预后评估的标记物，有望成为卵巢癌治疗的潜在靶点。

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（收稿日期：2021-04-15）