升金湖越冬小白额雁和同域家鸭的肠道寄生虫多样性研究

龚治忠, 李清月, 汪 冲, 徐曹玲, 刘 刚

(安徽医科大学 生命科学学院， 合肥 230000)

鸟类是一些疾病的天然宿主和传播媒介，由于具有极强的地理扩散能力和广泛的分布范围，其携带的寄生虫可以传播给其他动物和人类，从而引发一系列疾病[1-3]。作为人禽共患病的重要宿主及传播媒介，候鸟和家禽在一些流行性疾病的发生和传播中扮演着重要角色。鸟类的区域性活动和季节性迁徙为寄生虫疾病的传播和扩散带来了潜在风险，鸟类迁徙时携带的寄生虫通过身体接触或空气、水、食物等传播媒介传染给家禽，家禽再传染给人类，从而引起疾病的发生和传播，对鸟类甚至人类健康带来严重的公共卫生威胁。研究表明，迁徙水鸟和家禽感染的球虫(Coccidea)、线虫(Nematode)、吸虫(Trematode)和绦虫(Cestode)等寄生虫在肠道寄生虫病的发生和传播中起重要作用[4-7]。近年来，鸟类与家禽之间疾病传播规律已经引起人们的广泛关注，成为鸟类学和流行病学研究的热点问题[8-10]。

长江中下游地区湿地蕴含丰富的水生生物资源，是东亚-澳大利西亚(East Asian-Australasian)迁徙水鸟的重要迁徙停歇地和越冬地，也是我国人口密度较大的地区[10-11]。近年来由于过度开发，使越冬鸟类的栖息地不断减少，致使家禽与迁徙鸟类共同觅食或活动，进而加大了鸟类和家禽之间寄生虫传播的风险[3]。小白额雁是长距离迁徙的水鸟，是雁形目中重要的湿地指示物种，具有广阔的活动空间和复杂的生活习性，是长江中下游地区越冬的常见鸟类，该物种在球虫、线虫、绦虫等寄生虫疾病的传播和扩散中扮演着重要角色。长江中下游地区尤其是升金湖地区的人类农业活动使越冬小白额雁的栖息地不断减少，使其摄食方式和行为发生改变，导致其放弃已经退化的原始觅食栖息地，转向稻田以获取充足的食物[12]。前期研究发现，在小白额雁越冬湿地的周边有大量的家禽养殖场，常出现饲养家禽和小白额雁在相同水域混群觅食的现象，这种混群行为增加了寄生虫相互传播的机会，造成寄生虫疾病在家禽、候鸟之间周期性的暴发和循环感染。因此，越冬候鸟和家禽之间的寄生虫流行病学研究值得进一步关注。研究通过对升金湖越冬小白额雁和同域家鸭肠道寄生虫的多样性、感染强度和群落结构进行分析，揭示越冬水鸟和同域家禽寄生虫的传播规律，为鸟类寄生虫疾病甚至人禽共患寄生虫疾病的预防提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 粪便样本来源与采集

2017年11月至2018年4月从升金湖的杨峨头村、西园村、联合村和王坝村4个采样点采集越冬小白额雁和家鸭粪便样本各350份。越冬小白额雁的粪便样本采集自升金湖滩涂及稻田，家鸭粪便样本采集自滩涂及稻田放养的养殖场(表1)。釆集越冬小白额雁粪便样本前用望远镜观察其觅食群体，选取种群数量在50只以上且四周没有其他鸟类活动的集群并观察至少1 h，等候越冬小白额雁完成觅食并飞往下一个栖息地后，立即前往该区域采集新鲜粪便样本，为避免个别样本重复采样，采样距离至少为2 m。采集新鲜粪便样本时佩戴一次性PE手套，每只手套采集一份样本后便更换，将所有新鲜粪便样本单独收集于含10%福尔马林的20 mL样品收集管中，贴上标签后置于冰盒运回实验室，放-20 ℃冰箱保存。

表1 越冬小白额雁和家鸭粪便样本采集信息

1.2 方法

1.2.1 小白额雁粪便样品鉴定

采用粪便样本DNA提取试剂盒(Qiagen QIAamp R DNA Stool Mini Kit)从采集的越冬小白额雁粪便样本中提取DNA，通过设计细胞色素氧化酶亚基1(COI)基因的引物(上游引物5′-TTC TCC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC-3′，下游引物5′-ACG TGG GAG ATA ATT CCA AAT CCT G-3′)对提取的DNA进行PCR扩增，并将扩增产物送至生工生物科技有限公司进行测序，将测序得到的序列通过GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行比对分析，结果显示所有粪便样本均含有小白额雁的DNA，即采集的粪便样本为小白额雁粪便样本。

1.2.2 寄生虫检测方法

粪便样本中的肠道寄生虫采用饱和盐水漂浮法和离心沉淀法进行检测。饱和盐水漂浮法：取2 g新鲜粪便样本置于烧杯中并用镊子将其压碎，加入适量饱和盐水充分混匀，用粪筛过滤至锥形瓶中，继续加入饱和盐水至锥形瓶瓶口，盖上载玻片，静置5～10 min后取下载玻片进行镜检观察与记录。离心沉淀法：取2 g新鲜粪便样本于烧杯中并加入饱和盐水混匀，用过滤筛过滤至离心管，将离心管放置于低速离心机中离心2～3 min，弃去离心管内上清液，加入饱和盐水混匀后再次离心，反复操作2～3次直至上清液澄清透明，弃去上清液后吸取适量沉淀至载玻片并进行镜检观察与记录。

1.2.3 寄生虫鉴定

采用显微镜镜检技术对粪便样本中的肠道寄生虫进行鉴定。将含有粪便样本的载玻片置于10倍镜和20倍镜下，对寄生虫进行形态学观察并计数，而在低倍镜下无法确定的寄生虫种类，将其置于400或1 000倍镜下进行观察计数。通过测量和比较寄生虫繁殖体(卵及其卵囊)的形状、大小、卵壳厚度、特殊的部件以及内部成分等，对寄生虫种类进行识别鉴定。

1.3 数据统计与分析

统计并计算所有粪便样本中检测到的寄生虫感染率，即感染寄生虫的粪便样本(阳性样本)数量占检测的样本总量的百分比。寄生虫感染强度即每克粪便样本中寄生虫虫卵及其卵囊的数量。寄生虫多样性通过寄生虫丰富度、多样性和均匀度进行描述。寄生虫丰富度即每个单独粪便样本中检测到的寄生虫种类的数量，寄生虫的多样性通过Shannon-Wiener指数进行计算，寄生虫均匀度通过Pielou指数进行计算。

感染率：P=阳性样本数/每个采样点检测的所有样本数，%。

Pi=特定的寄生虫繁殖体的数量/收集的样本试验中所有寄生虫繁殖体的数量，%。

采用卡方检验和Fisher’s确切检验确定差异的统计学意义。用R3.6.0比较越冬小白额雁和家鸭的寄生虫丰富度、多样性和均匀度。群落相似性指数C=2c/(a+b)，c是越冬小白额雁的数目，a是越冬小白额雁寄生虫感染的数量，b是家鸭寄生虫感染的数量。采用Microsoft Excel和IBM SPSS Statistics v 19.0进行统计分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

从升金湖越冬小白额雁粪便样本中共鉴定出13种肠道寄生虫，包括2种球虫、6种吸虫、3种线虫和2种绦虫；从家鸭粪便样本中鉴定出11种肠道寄生虫，包括1种球虫、5种吸虫、3种线虫和2种绦虫(表2，图1)。在升金湖越冬小白额雁和家鸭中均发现6种肠道寄生虫，包括鹅艾美尔球虫(Eimerianseri)、接睾棘口吸虫(Echinostomaparaulum)、卷棘口吸虫(Echinostomarevolutum)、锐形裂口线虫(Amidostomumacuta)、鸭双睾绦虫(Diorchisanatine)和膜壳绦虫(Hymenolepissp.)，占全部寄生虫的27.8%(表2)。通过对感染寄生虫的粪便样本进行寄生虫组分分析，发现吸虫所占比例最多，在越冬小白额雁和家鸭中分别占46.2%和45.5%；其次为线虫，分别占23.2%和27.3%；再次为绦虫，分别占15.4%和18.2%；球虫所占的比例最少(15.2%，9.0%)，具体见图2。研究发现，在350份越冬小白额雁粪便样本中共检测出13种寄生虫，感染率为67.4%，而在350份家鸭粪便样本中检测出11种寄生虫，感染率为70.1%。不同寄生虫间的感染率存在较大差别，感染率最高的寄生虫是球虫(小白额雁为57.5%，家鸭为50.1%)，其次是线虫(16.5%，16.7%)和吸虫(6.0%，6.7%)，而绦虫(1.6%，1.2%)的感染率最低(表3)。

表2 越冬小白额雁和家鸭肠道寄生虫的感染情况

(a)艾美尔球虫(100倍镜，标尺=5 μm)；(b)卷棘口吸虫(40倍镜，标尺=20 μm)；(c)并殖吸虫(40倍镜，标尺=20 μm)；(d)棘口吸虫(40倍镜，标尺=50 μm)；(e)毛圆线虫(40倍镜，标尺=50 μm)；(f)毛细线虫(10倍镜，标尺=50 μm)。图1 从粪便样本中分离出的肠道寄生虫种类Figure 1 Some intestinal parasite species isolated from faeces

图2 越冬小白额雁和家鸭粪便样本中各种寄生虫的比例Figure 2 Proportion of various parasite species in Anser erythropusand the poultry duck

表3 越冬小白额雁和家鸭肠道寄生虫感染率

研究发现大多数阳性样本含有1种或2种寄生虫，含有1种寄生虫的样本数量多于含有2种或2种以上的样本数量，而含有3种或3种以上寄生虫的样本数量显著减少，含有4种寄生虫的样本数量最少，未感染的样本在小白额雁中占30.3%，在家鸭中占44.50%(图3)。小白额雁和家鸭感染的肠道寄生虫之间没有检测到显著的物种丰富度差异(F=0.67，P=0.656)、多样性差异(F=0.76，P=0.598)和均匀度差异(F=0.73，P=0.612)，而升金湖越冬小白额雁种群与家鸭种群的寄生虫群落却具有较高的相似性，相似系数为0.43。

图3 升金湖越冬小白额雁和家鸭粪便样本中寄生虫的物种丰富度及其比例Figure 3 Proportion of various species richness detected inAnser erythropus and the poultry duck

3 讨论和结论

升金湖越冬小白额雁(67.4%)和家鸭(70.1%)的寄生虫感染水平与灰鹤(78.9%)、白头鹤(57.7%)等其他在长江中下游湿地越冬水鸟的寄生虫感染水平相似[4,13]。在所有检测样本中，感染率最高的是球虫，其次是线虫、吸虫和绦虫，与升金湖越冬白头鹤肠道寄生虫的感染种类类似[1]。通过对长江中下游多种越冬水鸟肠道寄生虫研究[1]表明，感染率最高的是艾美尔球虫，这与本研究类似，艾美尔球虫能够对幼鸟造成严重伤害或者致死，过高的种群密度会增加球虫感染的风险。线虫也是越冬小白额雁和家鸭肠道寄生虫群落中相当重要的组成部分，本研究发现的线虫感染如毛圆线虫属和毛细线虫属在以往有关长江中下游越冬白头鹤肠道寄生虫的文献中均有报道[1]。吸虫和绦虫在很多野鸟和家禽中会造成宿主贫血、衰弱等症状，在本研究中，吸虫的种类最多，两者也是威胁越冬小白额雁和家鸭的重要肠道寄生虫。

通过对升金湖越冬小白额雁和家鸭的肠道寄生虫的群落结构分析表明，升金湖越冬小白额雁和家鸭的寄生虫群落相似系数为0.43，而差异性不显著，该相似性可能是由于两者间的寄生虫交叉感染导致的。宿主和寄生虫的密度以及它们的空间分布是影响寄生虫传播的重要因素，当宿主密度在一定阈值内时, 密度越大，寄生虫与宿主接触的机会越多，寄生虫感染的概率越大[14]。升金湖越冬小白额雁往往以大规模集群形式进行越冬，而家鸭更是集成化养殖，这种高密度的聚集增加了宿主之间相互接触的概率。近年来，随着人为干扰和栖息地的破坏，越冬小白额雁和家鸭经常在升金湖的湖岸滩涂共同觅食，形成的高密度混群大大增加了肠道寄生虫发生与传播的风险[15-16]。此外，肠道寄生虫与宿主的栖息地环境及食性密切相关，研究发现，寄生虫的暴发通常发生在感染性卵囊积累的环境中感染性卵囊越多，寄生虫暴发的可能性越大[12]。已有研究表明，升金湖越冬小白额雁主要栖息于升金湖地区的水田和滩涂草地，而养殖的家鸭白天也在此活动觅食，并都以苔草、禾本科植物、双子叶植物作为主要的食物来源[17]。由于觅食地重叠、食性相似、混合种群密度高和生态位重叠等因素导致越冬小白额雁与家鸭寄生虫群落结构相似，而且，越冬小白额雁与家鸭间的寄生虫交叉传播增加了人类感染寄生虫病的风险，并造成潜在的公共卫生风险[18]。

综上，升金湖越冬小白额雁和家鸭种群寄生虫群落结构相似，寄生虫感染率较高，表明升金湖水鸟越冬期寄生虫更加容易发生与传播，并且可能导致人类疾病，甚至引发潜在的公共卫生风险。研究对预防越冬水鸟和家禽的寄生虫交叉传播具有重要的意义，有利于进一步揭示寄生虫在越冬水鸟和家禽之间发生与传播的规律，从而为预防寄生虫病奠定基础。