果桑菌核病防治用药对家蚕生长发育的影响

吴 凡， 李德臣， 贺 真， 陈登松

(1. 湖北省农业科学院 经济作物研究所，武汉 430070；2. 湖北省农业科学院 果树茶叶研究所，武汉 430070)

桑树(MorusalbaL.)是重要经济树种之一。桑叶是唯一能使家蚕形成经济效益的天然饲料，而桑果(即桑椹)不仅可作水果鲜吃，还可加工成饮料、果酒与调味品等，含丰富的维生素和药用成分，对人体健康大有裨益[1-4]。果桑菌核病是一种由核盘菌(ScleritiniasclerotioumLib.)等真菌引起的疾病[5]，能够危害包括果桑在内的75科278属408种或亚种植物[6]，如油菜、烟草、番茄、大豆、花生、向日葵等，也是果桑生产上亟待解决的主要病害。果桑菌核病一旦发生，轻则减产30%～50%，重则可达80%，甚至绝收，严重影响果桑栽植的经济效益[7]。化学防治是目前果桑生产中防治桑椹菌核病最常用的方法之一[8-10]，而化学防治常用农药主要有多菌灵、甲基硫菌灵和腐霉利。

在蚕桑生产上，要实现桑园比较效益的大幅度提高，需要大力发展果叶兼用桑园，春季进行桑果采摘和养蚕，秋季进行养蚕，实现蚕茧和桑果的双丰收，提高亩桑生产效益，培育蚕桑产业新业态。因此，本文探讨了果桑菌核病防治常用药多菌灵、甲基硫菌灵和腐霉利对家蚕生长发育的影响，为果叶兼用桑园中果桑菌核病的防治和养蚕用桑安全提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试家蚕品种和药剂

供试家蚕品种为楚风×汉韵，由湖北省农业科学院经济作物研究所提供。蚕卵采用二段催青法进行催青，幼虫在26 ℃～29 ℃，湿度75%的条件下用桑叶饲育。供试药剂为多菌灵可湿性粉剂(天津市汉邦植物保护剂有限责任公司，有效成分含量80%，简称：多菌灵)、腐霉利可湿性粉剂(日本住友化学株式会社，有效成分含量70%，简称：腐霉利)、甲基硫菌灵可湿性粉剂(江苏龙灯化学有限公司，简称：甲基硫菌灵)。添食浓度即为大田用药浓度，即分别配制成5.35 mg/mL的多菌灵药液、10.65 mg/mL的腐霉利药液和10.65 mg/mL的甲基硫菌灵药液作为添食药液，添食清水作为对照，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 添食试验

采摘桑树盛产期的第3～4位叶，除去表面粉尘等杂物，挑选大小均匀的桑叶，用打孔器将桑叶打成直径为3 cm的圆片，然后将圆形桑叶浸于不同的供试药液中10 s，取出自然晾干。挑选健康且发育较为一致的二龄起蚕进行试验，每种药液处理设置3个重复，每重复30头家蚕，添食清水作为对照，从二龄起蚕开始添食，第1次添食给予桑叶10片，每日给桑3次，随着龄期的增长，给予适量、适龄、适熟的桑叶，以每次给桑前剩余少量桑为标准，每餐添食，至家蚕上蔟，处理组和对照组在相同的环境条件下饲育。观察不同药液添食处理后，家蚕的生长发育情况，记录每龄龄期经过、眠起情况、五龄盛食期家蚕体重，并在上蔟7 d后调查全茧量、茧层量、茧层率和死笼率。

1.3 家蚕肠内抗氧化酶活性的测定

将二龄起蚕按1.2方法添食不同药液，至五龄第 4天，各处理随机取幼虫各6头，在冰水浴条件下解剖获取中肠，用生理盐水洗净，滤纸吸干后称取100 mg。按1∶ 9(kg/L)的比例在中肠中加入预冷的生理盐水(0.86%)，冰水浴条件下机械匀浆，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min后，取上清液，制备成10%的组织匀浆液。匀浆液中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝比色法；家蚕中肠组织中过氧化氢酶(CAT)的活性测定采用可见光法；过氧化物酶(POD)活性的测定采用比色法。蛋白含量测定试剂盒以及CAT和POD活性测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，具体操作按照说明书进行。每组样品不少于3个生物学重复。其中，每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为1个CAT酶活力单位，在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1 μg底物的酶量定位为1个POD酶活力单位。

1.4 数据处理与分析

所有数据均采用GraphPad Prism 8软件进行处理，各处理组与对照组(清水)之间的差异采用student’st-test进行统计分析，表和图的数值均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 药物添食对家蚕生长发育的影响

添食甲基硫菌灵可湿性粉剂的家蚕，幼虫食欲明显减弱，从添食起，一直维持二龄起蚕状态，发育停滞不前，并在添食10 d左右陆续死亡，死亡时维持二龄起蚕体态，不吐水，软化而死。添食多菌灵可湿性粉剂和腐霉利可湿性粉剂的家蚕可正常发育至上蔟结茧，但是与对照之间的发育有开差，但是开差不大。

在五龄第4天，从每处理的3个生物学重复中随机称取10头蚕，求平均每头蚕的体重。结果见表1。除添食甲基硫菌灵不能正常发育外，添食多菌灵和腐霉利可湿性粉剂的家蚕体重均变小，其中，添食多菌灵家蚕的体重平均为2.588 g，达到对照的90.02%，添食腐霉利家蚕的体重为2.543 g，只达到对照的88.45%，两种处理家蚕的体重与对照均达到显著性差异。

表1 药物添食对五龄第4天家蚕体重的影响Table 1 The effect of drug supplementation on the weight of silkworm on the fourth day of fifth instar

2.2 药物添食对家蚕龄期经过的影响

从二龄起蚕开始，持续添食对各龄幼虫龄期经过的影响见表2。添食甲基硫菌灵可湿性粉剂对家蚕的龄期经过的影响较大，使家蚕的生长发育停滞，添食多菌灵可湿性粉剂的家蚕龄期经过缩短，添食腐霉利可湿性粉剂的家蚕，龄期经过增加。二龄经过，家蚕添食多菌灵后比对照短3 h，添食腐霉利比对照延长5 h，与对照相比均达到显著性差异；三龄经过，添食腐霉利的与对照相差不大，但是添食多菌灵的比对照显著缩短；四龄和五龄经过，添食腐霉利的比对照显著增加，添食多菌灵的比对照显著缩短，均达到显著性差异。

表2 自二龄起蚕开始添食药物对二至五龄幼虫龄期经过的影响Table 2 The effect of silkworms starting to add drugs since the second instar on the passage of 2-5 instar larvae

2.3 药物添食对家蚕茧质成绩的影响

在上蔟后7 d采茧，对茧质成绩进行调查，结果见表3。添食多菌灵和腐霉利对家蚕的茧质成绩造成一定的影响，添食多菌灵后，家蚕的全茧量、茧层量分别为1.39 g、0.316 g，茧层率22.73%，与对照相比均降低，死笼率为6.02%，比对照增加了4.27%，其中全茧量、茧层量、死笼率与对照相比达到显著性差异。添食腐霉利后全茧量为1.77 g，比对照增加了2.31个百分点，茧层量和茧层率分别为0.392 g和22.15%，与对照相比均降低，死笼率为13.16%，相比对照增加了11.41%，其中茧层量、茧层率、死笼率与对照相比达到了显著性差异。

表3 药物添食对家蚕茧质成绩的影响Table 3 The effect of drug supplementation on the quality of silkworm cocoon

2.4 药物添食对家蚕肠抗氧化酶活性的影响

自二龄起蚕持续添食多菌灵和腐霉利，测定五龄第4天幼虫肠内POD 酶、CAT 酶活性变化，结果如图1所示。由图1(a)可知，持续添食多菌灵和腐霉利，五龄第4天幼虫肠内CAT酶活力均比对照升高，但是差异不显著(P>0.05)；由图1(b)可知，五龄第4天幼虫肠内POD酶活力均比对照升高，达到显著性差异(多菌灵P=0.001 9，腐霉利P<0.001)。

**表示与对照组相比差异显著。图1 自二龄起蚕持续添食多菌灵和腐霉利后五龄第4天幼虫中肠内CAT(a)和POD(b)的酶活力变化Figure 1 Variations of CAT(a)and POD(b)activity in midgut of Bombyx mori larvae on day 4 of the 5th instar after treating the 2rd instar newly exuviated silkworm larvae continuously with carbendazim and procymidone

3 讨论与结论

家蚕是重要的经济型昆虫，是进行鳞翅目昆虫研究的模式生物，对环境比较敏感，尤其对农药等的适应性很弱[11]，每年因为农药中毒造成蚕茧产量的大量减产，蚕茧损失在30%以上[12]，蚕农经济损失巨大，已经成为制约蚕业发展的重要因素之一。果桑菌核病的防治主要在春季发芽开花期，采用单一喷施多菌灵、甲基硫菌灵和腐霉利或者是几种药物混合喷施的方法进行防治，如果用药不当，很容易引起春蚕中毒，造成蚕农经济损失。因此，如何在保证桑果丰收的前提下，维护家蚕饲养的安全成为业内专家亟需解决的问题。研究了3种常用的果桑菌核病防治用药对家蚕生长发育的影响，发现甲基硫菌灵对家蚕的生长发育影响最大，使家蚕不能完成世代发育，多菌灵和腐霉利对家蚕的生长发育、五龄盛食期的幼虫体重和茧质成绩都有所影响，但是能完成世代发育，表明3种菌核病防治用药中，甲基硫菌灵对家蚕的毒性最大，多菌灵和腐霉利虽然对家蚕有一定的毒性，但是家蚕可上蔟结茧，因此在果叶兼用桑园菌核病的防治用药中，应禁止使用甲基硫菌灵，可用多菌灵和腐霉利进行防治，可在保证桑果丰收的同时，尽量减少化学防治用药对家蚕的危害。谢道燕等[13]对家蚕添食低浓度的草甘膦和草铵膦这2 种桑园常用除草剂，发现添食后，虽未直接造成家蚕的死亡，但是对家蚕的生长发育和产茧量产生了一定的影响，认为农药对家蚕的残毒性应该以家蚕是否异常为标准。以这个标准进行判断，多菌灵和腐霉利对家蚕还是有一定的残毒性，对果叶兼用桑园菌核病的防治最好采用生物防治的方法。袁红霞等[14-15]分别研究了辛基酚和壬基酚对家蚕生长发育的影响，发现辛基酚和壬基酚都对家蚕生长发育毒性影响有显著的浓度效应和时间效应。韦润宇[16]对二龄起蚕添食噻虫啉、噻虫胺，发现在较高浓度时家蚕的全茧量、茧层量和茧层率下降，死笼率上升，较低浓度时对家蚕的生长发育和茧质成绩有一定的促进作用。王安皆等[17研究了桑叶喷施多菌灵对家蚕生长发育的影响，发现家蚕食桑量减少，体重下降，全茧量、茧层率和产卵量也随着浓度增大而降低。

昆虫体内有很多抗氧化酶，如 POD、CAT 与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，这些抗氧化酶可以增强昆虫对不良环境胁迫的抵抗能力[18]。POD是昆虫抗氧化酶系统的重要组成部分，该酶是以铁卟啉为辅基，以H2O2作为受体，可催化多种氧化产物，可清除体内多余活性氧和氧化产物的毒性[19]。CAT 与GSH-Px主要催化过氧化氢分解为水和分子氧，以避免过氧化氢在昆虫体内大量积累造成细胞氧化损伤，进而保护昆虫的正常代谢活动[20]。研究表明从二龄起蚕开始，对家蚕添食多菌灵和腐霉利可湿性粉剂，五龄4 d的家蚕体内CAT酶和POD酶活力均升高，表明家蚕为防止农药中毒，通过POD和CAT等抗氧化解毒酶的联合作用，提高了蚕体清除自由基的能力，尽可能的减轻农药中毒对机体的损伤。袁红霞[21]和张蒙蒙[22]等的研究结果也说明了这一点，这可能是家蚕对不良环境条件的一种适应性反应。但是多菌灵、甲基硫菌灵和腐霉利对家蚕生长发育影响的具体分子机制有待进一步研究，而且甲基硫菌灵对家蚕的致死机制也有待进一步探讨。