小麦TaZFP33基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位与表达分析

巫 群， 李永亮， 邹肖肖， 孙傲龙， 林晓霞， 周 苹， 郭新红

(湖南大学 生物学院 植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室，长沙 410082)

小麦是单子叶禾本科植物，在全球范围内广泛种植。作为人类的主食之一，小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、烟酸及维生素A等重要人体所需营养物质。转录因子是与启动子区域DNA相互作用的蛋白质，能够抑制或激活其他基因转录表达[1]。锌指蛋白(Zinc finger protein)是一类具有“手指状”结构域的转录因子，其特征是通过肽链中氨基酸残基的特征基团与Zn2+的结合来稳定一种很短的，可自我折叠成“手指”形状的多肽空间构型[2]。锌指蛋白是在真核生物中具有重要调控作用的一种核酸结合蛋白。锌指结构具有两个半胱氨酸和两个组氨酸，他们与Zn2+以配位键结合，形成一个具有两个反向平行的β-折叠和一个α-螺旋的指状结构[3]。根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)的数量和位置将锌指转录因子分为C2H2、C2C2、C2HC、C2C2C2C2、C2HCC2C2等多种类型，植物C2H2锌指蛋白是数量最多的也是目前研究较为广泛的一种。

目前报道的植物C2H2型锌指蛋白主要参与植物各个时期的生长发育，以及环境胁迫下基因的表达调控[4]。近年来，国内外有关植物C2H2锌指蛋白的研究逐渐增多，尤其是对拟南芥、水稻及矮牵牛等植物研究较多，但对小麦中的C2H2锌指蛋白研究较少。小麦作为全球范围内的主要粮食作物，干旱、盐渍化等问题严重影响着小麦的种植生产。小麦Q型C2H2锌指蛋白形成了转录因子的一个亚家族，其包含植物特异性QALGGH氨基酸基序。目前，面包小麦中共鉴定出47个Q型C2H2锌指蛋白基因[5]。小麦新基因TaZNF显著提高了转基因拟南芥的耐盐性[6]，过表达小麦锌指蛋白基因TaZFP1B的植物在生命周期的关键时期更耐旱[7]，小麦C2H2锌指蛋白基因TaZAT8对无机磷酸盐(Pi)胁迫具有耐受性[8]。本研究以小麦Q型C2H2锌指转录因子家族基因TaZFP33为研究对象，对TaZFP33基因的克隆、生物信息学分析、瞬时表达分析、组织特异性表达分析，以期为小麦TaZFP33基因功能和植物生理作用机制研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型小麦材料为澳大利亚联邦科工组织农业部St. Lucia小组薛刚平教授课题组保存的Fielder小麦品种。小麦种植于植物培养室(光照16 h，22 ℃，湿度60%；黑暗8 h，16 ℃，湿度80%；光照强度500 μmol/m2·s)；本氏烟草种植于植物培养室(22 ℃，长日照16 h/8 h，湿度80%，光照强度500 μmol/m2·s)，培养5.5周。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成

RNA提取采用Vazyme公司的Trizol试剂盒，实验材料于-80 ℃冰箱保存，按照Invitrogen公司提供的反转录试剂盒进行cDNA链的合成，并于-20 ℃保存备用。

1.2.2 小麦TaZFP33基因获取

从植物转录因子数据库[9]中得到拟南芥和水稻Q型C2H2锌指蛋白基因序列，利用这些基因中Q型C2H2锌指结构域序列在PlantGDB(http:∥www.plantgdb.org)数据库中进一步比对得到小麦C2H2锌指基因EST序列，然后通过Ensembleplants(http:∥plants.ensembl.org)进一步比对得到的序列，找到特异的序列(碱基序列相似性在98%以上的认为是同一个基因)。

1.2.3 小麦TaZFP33基因引物设计和基因克隆

通过在线网站Primer 3plus(http:∥www.bioinformatics.nl)设计引物(表1)，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增程序为预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃15 s, 35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的特异性。

表1 TaZFP33基因克隆的引物

1.2.4TaZFP33基因的生物信息学分析

利用在线网站对TaZFP33的基因启动子，蛋白的理化性质、亚细胞定位、疏水性和二级结构组成进行分析，如表2所示。从NCBI中下载已知各物种锌指蛋白氨基酸序列，利用ClustalX进行多 重序列比对，MEGA7软件设置以邻接法用于构建TaZFP33基因与其他物种锌指蛋白系统进化树。

表2 在线分析功能网站及网址

1.2.5 融合表达载体的构建

采用Vazyme公司的onestep ClonExpress试剂盒进行融合表达载体的构建。首先，用限制性内切酶XbaI单酶切pCAMBIA2300-GFP载体。然后，以cDNA为模板，用特异性扩增引物进行PCR体外扩增，将得到的目的片段切胶回收。于冰水中进行以下10 μL体系重组反应：ddH2O 1 μL，5×CEⅡ Buffer 2 μL，线性克隆载体4 μL，插入片段2 μL，ExnaseTMⅡ 1 μL。37 ℃水浴30 min，冰浴5 min，重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，冰上放置30 min，42 ℃热激90 s，加入900 μL LB培养基，37 ℃摇菌1 h，将菌液均匀涂布于卡那霉素培养基上，倒置于30 ℃培养箱中，12 h后挑单菌落，进行PCR检测为阳性后，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。

1.2.6 农杆菌转化

将10 μL质粒DNA加到100 mL冷冻的AG10感受态中，直接从液氮中在37 ℃的水浴中热冲击5 min，液氮30 s，重复4次，加入900 μL无抗LB培养基，28 ℃孵育3 h，将菌液均匀涂布于含有利福平和卡那霉素的固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱中，2 d后观察结果。

1.2.7TaZFP33的瞬时表达分析

挑农杆菌单菌落到5 mL含有利福平和卡那霉素的液体培养基中，28 ℃孵育到第2天，将1～1.5 mL的培养物移入无菌的1.5 mL管中，在室温(24 ℃)下以10 000 r/min沉淀细胞10 min，除去上清液，加入1 mL侵染液并重悬，不断添加浸染液，直至OD值在0.5～1.0，将烟草从培养室移至白光下1 h(以完全打开气孔以帮助渗透)，用注射器(移下针头)在叶子下面轻轻擦拭一个小区域，轻轻将侵染液注射进烟草叶片，并做好标记。在培养室放置2～3 d，切除1～2 cm2的叶组织，制作切片，使用共聚焦显微镜观察结果[10]。

2 结果与分析

2.1 TaZFP33基因的克隆和融合表达载体的构建

通过比对分析筛选出小麦Q型锌指蛋白TaZFP33转录因子，其基因全长510 bp，编码169个氨基酸(图1)。PCR扩增结果见图2，然后进行融合表达载体35S::TaZFP33-GFP的构建。

图1 TaZFP33全长核苷酸序列及编码氨基酸序列Figure 1 Full-length nucleotide sequence and putative aminoacid sequence of TaZFP33

M: DL5000 Marker; 1～5: TaZFP33 gene。图2 TaZFP33基因PCR扩增产物Figure 2 PCR amplication production of TaZFP33 gene

2.2 TaZFP33基因的生物信息学分析

2.2.1TaZFP33基因的启动子分析

通过小麦基因组数据库分析得到TaZFP33基因的启动子，利用在线网站PlantCARE对启动子进行分析。结果(表3)显示，TaZFP33的启动子含有较多的核心元件，这些调控元件主要包括：光响应元件(TCT-motif、I-box、chs-CMA2a)、厌氧诱导(ARE)、缺氧特异性诱导(GC-motif)茉莉酸甲酯响应(CGTCA-motif)、脱落酸响应(ABRE)、水杨酸(TCA-element)和与分生组织相关(CAT-box)的顺式作用元件。

表3 TaZFP33启动子顺式调控元件

2.2.2 TaZFP33的理化性质

通过ProtParam在线分析TaZFP33氨基酸理化性质，结果显示TaZFP33由169个氨基酸组成，分子质量为17.5 ku，理论等电点为6.43，分子式为C750H1191N229O240S8，原子总数为2 418，不稳定性指数为52.18，为不稳定蛋白，脂肪指数为69.05。

2.2.3 TaZFP33亚细胞定位与亲疏水性

由Euk-mPLoc 2.0在线工具预测得知该蛋白定位在细胞核上，为核蛋白。蛋白质亲疏水性的在线工具Protscale分析TaZFP33，结果(图3)表明该蛋白疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸，由此可推断该蛋白为疏水性蛋白。

分值>0表示疏水性；分值<0表示亲水性。图3 TaZFP33蛋白疏水性Figure 3 TaZFP33 protein hydrophobicity analysis

2.2.4 TaZFP33蛋白结构预测

采用SOPMA工具分析预测TaZFP33蛋白二级结构，结果发现(图4)α螺旋有89个氨基酸，占52.66%；无规卷曲60个氨基酸，占35.5%；延伸链13个氨基酸，占7.69%；β转角4个氨基酸，占4.14%。采用在线网站SMART对TaZFP33蛋白进行结构预测，结果表明该蛋白含有C2H2锌指蛋白结构域。

蓝色: α螺旋;红色: 延伸链;绿色: β转角;紫色: 无规则卷曲。图4 TaZFP33蛋白二级结构预测Figure 4 TaZFP33 protein secondary structure prediction

2.2.5 TaZFP33的进化树

在NCBI、Tair、Ensemble plant网站上用TaZFP33全长蛋白序列进行Blast比对搜索，并以此得到的结果构建进化树(图5)，结果表明TaZFP33(TraesCS5D02G369900)与拟南芥和水稻C2H2锌指蛋白基因的结构域高度保守。

图5 小麦TaZFP33与其他C2H2锌指蛋白的系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree analysis of wheat and other C2H2 zincfinger proteins

2.3 TaZFP33的瞬时表达

以空载体(pCAMBIA2300::GFP)侵染的烟草叶片为对照组，TaZFP33融合表达载体(pCAMBIA2300::TaZFP33)侵染的烟草叶片为实验组，注射烟草3 d后在激光共聚焦扫描显微镜下观察到绿色荧光。结果(图6)表明，对照组的细胞各个部位都显现绿色荧光，而TaZFP33表达载体侵染的烟草叶片只在细胞核内呈现绿色荧光，与生物信息学预测结果一致，表明TaZFP33是核蛋白。

Bright: 明场; GFP: 绿色荧光蛋白; DAPI：DAPI染色; Merge: 绿色荧光和明场图片的重叠。图6 TaZFP33亚细胞定位Figure 6 TaZFP33 subcellular localization

2.4 TaZFP33基因组织表达特异性

利用qRT-PCR分析小麦不同组织中TaZFP33的表达情况。小麦TaZFP33基因在胚、根、茎、叶中均表达，但不同部位的表达量不同，在胚中相对表达量最高，其次是根和茎，在叶中表达量最低(图7)。表明TaZFP33在小麦胚中起到重要的生物学作用。

图7 TaZFP33基因组织表达Figure 7 The relative expression of TaZFP33 gene in different tissues

2.5 TaZFP33基因在非生物胁迫响应下的表达

为进一步研究TaZFP33的生物学功能，采用qRT-PCR方法检测在100 μmol/L ABA、20% PEG6000、0.2 mol/L NaCl处理下，TaZFP33基因在根和叶中的表达情况。结果(图8)表明：在叶中，TaZFP33在NaCl处理后2 h表达水平出现峰值，与处理前(0 h)相比达到极显著差异；ABA处理0.5、1、2、5和10 h后与处理前(0 h)相比均达到极显著差异。20% PEG处理，6个时间点的表达情况较处理前均有极显著差异；在根中，TaZFP33在NaCl处理1 h后表达量达到最低值，在10 h时与处理前相比均达到显著差异；20% PEG6000处理后结果表明，TaZFP33在处理后表达量发生显著下调；ABA处理0.5、1、2、5和10 h后与处理前相比均达到显著差异，这表明TaZFP33对NaCl、PEG、ABA的处理产生响应。

(a)根；(b)叶。* 为表达量与处理前(0 h)相比差异显著(P<0.05); ** 为表达量与处理前相比差异极显著(P<0.01)。图8 ABA、PEG和NaCl处理后TaZFP33基因在根和叶的相对表达量Figure 8 The relative expression of TaZFP33 gene induced by ABA, PEG and NaCl

3 讨论与结论

锌指蛋白是真核生物体内最大的转录因子家族之一[11]，目前研究发现，锌指蛋白在哺乳动物和植物中都存在，但植物锌指蛋白远没有动物那么多。自第一个植物锌指蛋白在矮牵牛中被发现以后，在水稻、拟南芥、大豆、棉花、小麦中相继发现了锌指蛋白。Xu等[12]研究发现拟南芥C2H2型锌指蛋白SUPFRMAN与花药发育有关，表达较为复杂；Krichevsky等[13]研究表明拟南芥锌指蛋白AtCZS能抑制开花负调控因子FLC的表达。Morita等[14]研究表明拟南芥SGR5参与了早期芽向地性的调节。Lippuner等[15]筛选到拟南芥C2H2型锌指蛋白STZ，这是真核生物中发现的第一个耐盐胁迫的锌指蛋白；Vogel等[16]研究表明拟南芥Zat12参与氧化和非生物胁迫信号通路，Sugano等[17]研究表明矮牵牛基因ZPT2-3具有一定的抗旱能力。植物C2H2锌指蛋白参与了一系列生物学功能，其中包括发育调控和对逆境胁迫的响应[18]。

本研究通过公布的拟南芥和水稻C2H2类转录因子，与小麦数据库的EST序列进行比对分析获得小麦C2H2型锌指蛋白基因TaZFP33，对其进行克隆，得到长为510 bp，编码169个氨基酸的基因序列。TaZFP33基因编码的氨基酸具有植物Q型锌指蛋白转录因子的典型C2H2保守结构域，可说明TaZFP33基因属于小麦锌指蛋白基因家族成员。系统进化分析表明，TaZFP33(TraesCS5D02G369900)与拟南芥和水稻同源性较高，与拟南芥中基因ZFP1、ZFP2、ZFP3同源性最高，且这3个基因均参与ABA诱导的通路，从而影响种子发育和生长发育。而水稻中与之同源性最高的是一种假设的蛋白质，第二个接近水稻的同源物是ZOS8-13，它主要在种子中表达，并在盐胁迫下在叶片中上调[19]。启动子顺式作用元件研究结果表明TAZFP33的启动子具有脱落酸(ABRE)、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif)、水杨酸(TCA-element)等多种与胁迫相关的顺式作用原件。ABA调节不仅与植物的生长和发育相关，还影响生物和非生物胁迫[20]。Sato等[21]研究表明NCED3被硫酸盐强烈诱导，这是干旱的潜在化学信号，它会增加ABA水平并促进气孔关闭；You等[22]研究表明OsPEX5通过调节茉莉酸的生物合成调节水稻小穗的发育；Behr等[23]通过茉莉酸促进大麻下胚轴的二次生长；水杨酸受体NPR3在早期花朵发育过程中是防御反应的负调节剂[24]。前人研究结果证明脱落酸(ABRE)、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif)、水杨酸(TCA-element)等顺式作用原件与胁迫相关，推测基因TaZFP33受非生物胁迫响应。通过基因组织特异性表达分析说明TaZFP33在小麦茎、叶、根、胚中均有表达，经ABA、PEG6000和NaCl处理后，对TaZFP33基因在根和叶中的表达情况进行检测，结果表明TaZFP33在NaCl、PEG和ABA处理下均产生应答。这与启动子分析结果一致，因此推测TaZFP33基因可能受ABA诱导的胁迫响应。本研究通过对TaZFP33基因的克隆、生物信息学分析、瞬时表达分析、组织特异性表达分析，为深入研究TaZFP33基因的生物学功能的奠定了基础，同时也为小麦的抗逆性研究提供候选基因。