PD-1、PD-L1在口腔鳞状细胞癌中表达意义及对疾病预后价值研究

田国永 鹿国英 吕志军 付深利

中图分类号:R739.8 文献标志码：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.023

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一种具有侵袭性的上皮性肿瘤，其发生发展与多个基因表达异常有关，寻找有效的预后标志物对改善患者预后具有重要意义。程序性死亡分子1(programmed cell death 1，PD-1)是免疫抑制分子，可诱导程序性细胞死亡，程序性死亡受体-配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是PD-1配体之一，主要在恶性肿瘤组织中诱导表达，PD-1/PD-L1途径可限制过度免疫反应，保护正常组织免受损伤[1]。发生肿瘤时，诱导PD-L1表达升高，激活PD-1/PD-L1途径，促使肿瘤细胞逃避免疫系统杀伤，在体内存活增殖。已有研究显示，PD-L1在胰腺导管腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中异常高表达，通过靶向阻断PD-1/PD-L1通路，是促进抗肿瘤免疫应答的主要途径之一[2-3]。目前，PD-L1、PD-L1在OSCC中研究较少，本研究分析PD-L1、PD-L1在OSCC组织中表达，旨在探讨其对OSCC预后的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015 年06 月～2018 年03 月期间，本院收治的OSCC患者93 例，其中男性52 例，女性41 例，年龄35～72 岁。纳入标准：(1)首次确诊为OSCC，术前未进行任何治疗；(2)经颌面外科医生评估，可予以手术切除；(3)术后病理学确诊为OSCC；(4)接受手术及辅助放化疗的综合治疗方案。排除标准：(1)合并自身免疫性疾病；(2)合并有口腔黏膜疾病；(3)合并有其他部位肿瘤；(4)住院期间死亡患者。本研究获得所有患者及家属同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 HE染色及免疫组织化学染色

用10%中性甲醛固定肿瘤及癌旁组织，包埋、切片，脱蜡水化，常规HE染色，光镜下观察组织学变化。取切片，脱蜡水化，枸橼酸钠修复抗原，3%H2O2避光孵育10 min，PBS浸洗，加入山羊血清封闭液，加入PD-1单抗、PD-L1单抗4℃孵育过夜，复温，PBS浸洗，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，脱水、透明、封片，显微镜下观察。结果判定[4]：采用双盲法阅片，根据细胞染色强度评分，≤2 分为阴性(-)，>2 分为阳性(+)。

根据染色结果分析：(1)PD-1、PD-L1在癌旁组织和OSCC组织中的表达；(2)PD-1、PD-L1在OSCC组织中表达相关性；PD-1、PD-L1表达与临床病例参数相关性；(3)PD-1、PD-L1对OSCC预后预测价值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0统计分析，计数资料以(例，%)表示，组间比较采用χ2检验；生存率组间比较采用Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检验，Spearman采用相关分析法分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色结果

HE染色结果显示，癌旁组织黏膜上皮层次结构正常；OSCC组织细胞异型，呈核分裂像，鳞状上皮增生，癌细胞呈条索状或团块状侵入结缔组织内(图1)。

图1 组织病理学检查(HE， ×200)

2.2 PD-1、PD-L1在癌旁组织和OSCC组织中的表达

PD-1、PD-L1在OSCC组织中阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)(表1，图2～3)。

表1 癌旁组织和OSCC组织PD-1、PD-L1表达[n(%)]Tab 1 PD-1 and PD-L1 expression in OSCC and adjacent tissues[n(%)]

图2 PD-1在癌旁组织和OSCC组织中的表达(SP, ×400)

图3 PD-L1在癌旁组织和OSCC组织中的表达(SP×400)

2.3 PD-1和PD-L1表达的相关性

PD-1和PD-L1在OSCC及癌旁组织中表达无相关性(P>0.05)(表2)。

表2 PD-1、PD-L1表达在OSCC及癌旁组织表达相关性分析[n(%)]Tab 2 Correlation analysis of PD-1 and PD-L1 expression in OSCC and adjacent tissues[n(%)]

2.4 PD-1、PD-L1表达与患者临床病理参数的关系

低分化程度OSCC组织中PD-1阳性表达率高于高分化组织(P<0.05)；发生淋巴结转移和III～IV期OSCC组织中PD-L1阳性表达率高于未发生淋巴结转移及I～II期组织(P<0.05)(表3)。

2.5 PD-1、PD-L1表达对OSCC预后的影响

共82 例患者获得随访。PD-1、PD-L1阴性表达患者生存率均高于阳性表达患者(P<0.05)(图4)。

图4 PD-1和PD-L1阳性表达与阴性表达OSCC患者总生存率比较

3 讨 论

OSCC转移和发展涉及多基因共同作用，其中免疫学肿瘤微环境与OSCC发生发展过程密切相关[5]。T淋巴细胞介导肿瘤细胞免疫应答，肿瘤微环境中T淋巴细胞功能障碍是导致肿瘤细胞免疫逃逸的关键。PD-1及其配体PD-L1是重要免疫检查点，肿瘤细胞中PD-1与PD-L1结合，抑制T淋巴细胞免疫功能，促进肿瘤细胞免疫逃逸，与预后不良有关[6]。肿瘤微环境中免疫机制与OSCC关系密切，本研究通过检测PD-1、PD-L1在OSCC中的表达及意义，以期为OSCC免疫治疗提供实验指导。

肿瘤组织中PD-1、PD-L1高表达与肿瘤微环境中T淋巴细胞活化有关，阻断PD-1/PD-L1的免疫疗法有望成为新的替代治疗方法[7]。既往研究显示，PD-1、PD-L1在小儿脑肿瘤以及非小细胞肺癌患者中阳性表达率均较高[8-9]。本研究采用免疫组化法对OSCC患者癌旁组织和肿瘤组织中PD-1、PD-L1表达进行检测，结果显示，OSCC组织中PD-1、PD-L1阳性表达率明显高于癌旁组织，提示PD-1、PD-L1与OSCC发生发展有关，高表达PD-1、PD-L1可能促进肿瘤进展，为OSCC进行免疫治疗提供病理支持。另外，PD-1、PD-L1高表达还与肿瘤一些临床特征密切相关，Cao等[10]研究显示，结膜黑色素瘤患者可检测到PD-1、PD-L1表达，且PD-L1表达与远处转移及患者生存期有关。Zhou等[11]研究发现，鼻咽癌患者PD-1、PD-L1表达升高，PD-L1高表达与rTNM分期、贫血状态以及复发有关。郭晓宇等[12]报道，胃癌患者PD-1表达与浸润深度有关，而PD-L1表达与患者年龄、肿瘤分化程度、直径以及浸润深度有关。本研究进一步对PD-1、PD-L1表达与患者年龄、性别、发病部位、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移和TNM分期的关系进行比较，结果显示，低-中分化OSCC组织中PD-1阳性表达率高于高分化，发生淋巴结转移和III～IV期OSCC组织中PD-L1阳性表达率高于淋巴结未发生转移及I～II期，由此可知，PD-1、PD-L1不仅参与OSCC进展，并且两者阳性表达率随着OSCC恶性程度升高而增加，提示PD-1、PD-L1表达水平与OSCC患者病情程度有关。

PD-1、PD-L1作为肿瘤免疫逃逸中关键分子，在肿瘤中具有预后价值。Tan等[13]检测164例卵巢癌患者外周血单核细胞中PD-1、PD-L1表达水平，表明PD-1、PD-L1多态性可增加卵巢癌风险，二者表达异常与预后不良关系密切。Wyss等[14]发现，原发性结肠癌和肝转移瘤患者间质PD-1、PD-L1表达与患者肿瘤侵袭性生物学行为有关，可作为预后指标。在转移性透明细胞性肾细胞癌患者中，PD-1、PD-L1表达与肿瘤恶性程度及T淋巴细胞浸润相关，并可影响患者整体生存率[15]。本研究应用Kaplan-Meier生存曲线比较PD-1和PD-L1不同表达患者生存率，结果显示，PD-1和PD-L1高表达患者术后生存时间较低表达患者明显减少，提示PD-1、PD-L1与OSCC患者生存率有关，具有重要预后意义，PD-1、PD-L1表达越高，患者预后越差。

本研究初步显示，PD-1、PD-L1在OSCC患者中阳性表达率较高，与预后不良有关，可作为预后潜在生物标记物。但本研究选取样本量较少，PD-1、PD-L1在OSCC中具体作用机制尚需进一步大样本研究，为OSCC治疗提供实验支持，提高患者预后。