粒用高粱种质资源耐冷性分析

徐建霞，丁延庆，曹 宁，程 斌，高 旭，邹桂花，张立异

(1.贵州省农业科学院旱粮研究所，贵阳 550006；2.浙江省作物分子育种工程技术研究中心，杭州 310021；3.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州 310021)

高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]是世界第五大粮食作物[1]，起源于干旱、炎热和贫瘠的非洲地区，与其他粮食作物(小麦、玉米和水稻)相比，具有较强的抗旱、耐盐碱、耐贫瘠等特性[2-3]。我国高粱主栽区为西南、西北和东北，主要分为春作和夏作。西南地区处于春作区，播种时间较早。由于西南地区倒春寒现象频发，作为喜温作物的高粱对低温极为敏感，早春寡照低温多雨天气的出现，引起高粱种子在土壤中粉种或霉烂，导致萌发率、出苗率降低，还会导致出苗后植株长势弱且生长缓慢，造成低温损伤进而影响产量和质量[4]。因此，了解高粱的耐冷综合评价体系，筛选和鉴定出耐冷高粱种质，对于选育稳定高产的耐冷型高粱品种(品系)十分必要。

高粱不同品种(品系)间耐冷性比较及低温胁迫生理机制方面的研究国内外已有报道，Major等[5]对高粱品种Pride P 130苗期进行短期低温处理后发现，低温不仅延迟了开花天数还使分蘖数增多，但对株高和籽粒产量等性状的影响不显著。Upadhyaya等[6]研究发现，12 ℃显著影响高粱种子的萌发能力，可作为高粱萌发期耐低温的筛选温度，Franks等[7]研究认为，15 ℃适合作为高粱萌发期的鉴定温度。龚文娟等[8]对407份高粱的低温萌发筛选试验，初步确定高粱萌发的最低温度为8 ℃。张丽霞等[9]也认为，在8 ℃低温胁迫下相对萌发势和相对萌发率的高低可作为评价高粱种子的耐冷能力。目前，前人在评价高粱萌发期和幼苗期耐低温条件上存在许多差异，且前人研究的指标都比较单一，而高粱籽粒品质以及品种间的耐冷性比较研究鲜见报道。为了进一步开展高粱耐冷性研究，推进西南地区酒用高粱育种工作，本研究采用257份粒用高粱为试验材料，在10 ℃条件下测定种子萌发率以及幼苗4 ℃处理7 d后耐冷等级，结合籽粒品质，采用隶属函数和聚类分析法科学评价高粱幼苗的耐冷性。建立多因素高粱耐冷种质鉴定综合评价指标，为耐冷高粱品种(品系)的选育及高粱耐冷性科学鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为257份粒用高粱(编号为：GZ 001～GZ 257)，由中国农业科学院作物科学研究所、浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所和贵州省农业科学院旱粮研究所提供，分别来源于我国16个省市以及美国、日本和苏丹等国(表1)。

表1 高粱种质资源的来源及数目Table 1 Sources and numbers of sorghum germplasm resources

1.2 试验方法

1.2.1粒用高粱种质资源萌发期耐冷性试验设计

由于试验材料较多，基于前人研究结果，结合贵州近几年来4月份春播的最低温度，在试验之前以红缨子、河农16、BTx 623等10份材料进行预试验，选取8 ℃和10 ℃作为高粱种质资源萌发期耐冷性试验温度。结果发现，这些高粱品种在8 ℃下培养10 d发芽率都较低，因此选取10 ℃为发芽温度。

采用RXZ-1000 B型人工气候箱进行种子控温萌发培养，培养条件：光周期16 h/8 h，光照强度12 000 lx，湿度60%。挑选籽粒饱满的种子，用次氯酸钠溶液(5%)消毒15 min，再用纯水冲净拭干，置于铺有滤纸的培养皿中，每个培养皿放30粒种子，作好标记，加入15 mL蒸馏水后置人工气候箱进行培养。每天补充一次蒸馏水，培养10 d后记录每个材料的萌发率。每处理重复3次，随机区组排列。

1.2.2粒用高粱种质资源幼苗期耐冷性试验设计

参照《高粱种质资源描述规范和数据标准》以及张瑞栋等[10]的研究方法，将参试材料种于花盆内，每个材料30粒种子。置于人工气候箱中培养，培养条件：光周期为16 h/8 h，温度为25 ℃，光照强度为12 000 lx，待高粱种子萌发生长至三叶一心后，选取大小一致的幼苗各10株，置于胁迫温度为4 ℃的人工气候箱中进行低温处理(其余培养条件不变)，定期浇水。每处理重复3次，随机区组排列。7 d后记录幼苗表观特征，进行耐冷等级划分。

1.3 测定指标及方法

种子萌发率及统计标准[9-10]：10 ℃处理后第10天统计培养皿中种子的萌发粒数(以种子胚根达种子长，胚芽达种子长的二分之一为萌发标准)，进行统计分析。 高粱种子萌发率统计标准如表2。

表2 高粱种子萌发率统计标准Table 2 Statistical standard of sorghum seed germination rate

萌发率(%)=(第10天的发芽种子数/供试种子数)×100%。

低温胁迫下幼苗存活率及耐冷等级划分[11]：4 ℃处理后第7天时统计花盆中幼苗的存活数，记录幼苗表观形态特征，进行统计分析和耐冷等级划分(表3)。耐冷等级描述如表3。

幼苗存活率(%)=(第7天的幼苗种子存活数/供试幼苗数)×100%。

高粱籽粒品质(表3)参照王勇生等[12]的方法测定。

表3 幼苗耐冷等级和表观形态特征Table 3 Cold tolerance grade and morphological characteristics of seedlings

耐冷性综合评价方法：隶属函数平均值法作为植物抗逆生理实验中常用的方法，通过多项指标的综合评价来合理准确反映植物的抗逆性，从而消除个别指标带来的片面性和不可靠性，能客观比较出供试材料抗逆性的大小及差异。隶属函数平均值(U)越大，说明植物的抗逆性(本文中主要为耐冷性)越强[13]。

与耐冷性呈正相关的隶属函数公式为：

Uij=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

与耐冷性呈负相关的隶属函数公式为：

Uij=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

隶属函数平均值U计算公式为：

式中，Uij为i品种j指标的隶属函数值；Xij为i品种j指标的耐冷系数；Xmax为所有品种中此指标的最大值；Xmin为所有品种中此指标的最小值。Ui是为i品种的各性状的平均耐寒隶属函数值。

1.4 数据处理及分析

采用Microsoft Excel 2007软件和Origin 8.1软件进行数据处理及制图，利用 SPSS 20统计分析软件进行显著性检验和耐冷性指标的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 低温处理对高粱种子萌发率的影响

低温条件下种子的萌发率是评价种子耐冷的重要指标之一。257份高粱种质资源在低温(10 ℃)胁迫下的试验结果显示，种子低温萌发率较好的材料有120份(46.70%)，包括达到一级的60份材料和二级的60份材料，而低温萌发率较差的材料有57份(22.18%)，包括达到了五级的27份材料和六级的30份材料(表4)。

表4 低温条件下高粱种子萌发等级样品数占比Table 4 Number and percentage of sorghum seed germination grade samples under low temperature

2.2 低温胁迫对高粱幼苗表型特征的影响

不同材料的高粱幼苗经过4 ℃低温胁迫处理7 d(其余培养条件不变)后，均伴有叶片失水和颜色变浅等现象，部分材料还出现叶片萎蔫、下垂，局部坏死等现象；结合幼苗表观形态特征(表3)，将耐冷等级划分为五级。幼苗耐冷等级达到一级、二级和三级的材料具有较好的耐冷性，占所有样品比率的68.87%(177份/257份)，而耐冷等级为四级和五级的材料耐冷性较差，占总样品比例的31.13%(80份/257份)(表5)。说明经过4 ℃胁迫7 d后，不同高粱幼苗均会受到不同程度的损伤，对低温的抵抗能力表现不同。

表5 高粱幼苗耐冷等级样品数占比Table 5 Number and percentage of cold tolerance grade samples of sorghum seedlings

2.3 粒色与耐低温的关系

本研究所用的257份种质中，粒色(白色、灰白色)较浅的材料为20份、占比7.78%；粒色(褐色和红色)较深的材料为210份、占比81.71%。种子萌发率达到一级的材料共有60份，其中白粒材料最少(4份)，红粒材料最多(33份)，分别占6.67%和55%(表6)。

在10 ℃低温处理后，种子萌发率达到一级的材料白粒最少(为4份)，但占白粒材料的百分比却最多(66.7%)；而红粒和褐粒材料虽然最多，但筛选到的较耐低温材料比例却相对较低，占比分别为14.12%和26.4%(表6)。

表6 高粱粒色Table 6 Color of sorghum grain

2.4 种子萌发率、幼苗存活率与籽粒品质相关性分析

将种子萌发率、幼苗存活率与高粱籽粒成分(直链淀粉、支链淀粉、脂肪、蛋白质、含水量和单宁)进行相关性分析。结果(表7)表明，种子萌发率与种子脂肪含量和蛋白质含量之间呈极显著正相关，Pearson相关系数R值分别为0.253和0.164(p<0.01)，而幼苗存活率只与脂肪含量显著相关，Pearson相关系数R值为0.128(p<0.05)。此外，籽粒品质性状之间也表现出相关性；直链淀粉含量与支链淀粉呈极显著负相关(p<0.01)，脂肪与蛋白质呈极显著正相关(p<0.01)，单宁含量与颜色深浅呈极显著正相关(p<0.01)。

表7 高粱种子萌发率与籽粒品质之间的相关系数Table 7 Correlation coefficient between sorghum seed germination rate and grain quality

2.5 低温胁迫下种子高萌发率和苗期高耐冷能力种质筛选

在低温胁迫条件下，种子萌发率和苗期耐冷能力之间关系复杂，同样存在萌发率高、苗期耐冷能力强的材料。根据表2和表3的统计标准，将257份种质在低温条件下的种子萌发率和苗期耐冷能力分别划分到不同的等级中(表4、表5)，其中种子萌发率达到一级的样品数为60份，幼苗耐冷等级达到一级的样品数为36份，利用维恩图分析得出，种子萌发率和苗期耐冷能力均达到一级(高耐冷)的种质有7份(图1)，其中北方材料5份：GZ 001(253)、GZ 066(蛇眼)、GZ 125(1030)、GZ 162(257)和GZ 235(河农16号)，南方材料2份：GZ 241(泸州红2号)和GZ 249(黔高1号)。

图1 低温处理下种子萌发率和苗期耐冷能力维恩图Fig.1 Venn diagram of seed germination rate and seedling cold tolerance under low temperature treatment

2.6 低温胁迫下7份高耐冷高粱种质隶属函数综合评价

对低温胁迫下7份高耐冷高粱种质耐冷指标平均隶属函数值进行综合评价，U值越大，表示高粱幼苗的耐冷性越强。低温胁迫下7份高粱种质耐冷性U值从大到小的排序为：GZ 066、GZ 249、GZ 241、GZ 001、GZ 162、GZ 125、GZ 235(表8)。同时通过基于欧式平均距离法对U值进行聚类分析 ，将7份高耐冷高粱又分为三类，GZ 066、GZ 249和GZ 241 属于高强耐冷类型，GZ 001和GZ 162属于较强耐冷类型，GZ 125和GZ 235属于强耐冷类型(图2)。

表8 7份高粱种质耐冷指标隶属函数值及U值Table 8 Membership function and U value of cold tolerance index of 7 sorghum germplasms

图2 7份耐冷高粱种质聚类树状图Fig.2 Cluster tree diagram of 7 cold-tolerant sorghum germplasms

3 讨 论

高粱产量往往受到播种地点、播种时间等因素的影响，特别是早春播种的高粱更易遭受低温胁迫而导致种子萌发出苗生长受损，严重影响当季生产[9,14]。因此，筛选耐低温种质资源，以及明确相关作用机理，对今后高粱品种的选育和产业发展具有重要作用。

本研究通过对257份粒用高粱10 ℃低温胁迫处理结果得出，种子萌发率达到一级的样品数为60份，占总样品的23.35%；高粱幼苗4 ℃低温胁迫处理7 d后，幼苗耐冷等级达到一级的样品数为36份，占总样品的14.01%；而种子萌发率和幼苗耐冷能力均达到一级的材料只有7份。本研究结果与已报道的高粱耐冷试验结果相似。陈香兰等[15]从1 398份高粱材料中(其中471份材料用于萌发期抗冷材料的筛选，927份材料用于苗期抗冷材料的筛选)只选出9份材料耐低温性，而张桂香等[16]对238份高粱材料进行芽期和苗期的耐低温筛选，获得两个时期都耐低温的材料只有3份。上述研究结果也表明，种子萌发期与苗期抗低温能力并无明显相关性。

高粱粒色与耐冷性之间的关系已有相关报道。张丽霞等[9]对631份高粱材料进行了芽期耐冷性筛选，从中鉴定出芽期耐冷一级种质91份，其中白粒最多为47份(30.72%)；黄粒最少为7份(11.48%)。但张桂香等[16]对238份高粱材料进行了芽期耐冷性鉴定与评价，从中筛选出了芽期耐冷种质最多为红粒材料(7份)。本研究中低温处理后相对萌发率达到一级的白色籽粒占比最大(55%)，耐低温的深色籽粒比例较低(6.67%)。可能是试验材料中白色籽粒高粱种质很少导致。

本研究发现，种子萌发率与脂肪和蛋白含量之间表现出显著的正相关性。脂肪作为种子高能量贮藏物质，是植物生长发育中不可或缺的营养物质。方升佐等[17]和陈建华等[18]分别对青檀种子和棉花种子中脂肪含量与种子萌发率的研究表明，脂肪含量与种子萌发呈正相关，即脂肪含量越高种子萌发率越高。本研究也显示，种子脂肪含量越高，低温胁迫下萌发率越高，其原因是种子油脂在脂肪酶的作用下水解为甘油及游离脂肪酸，进而转化为葡萄糖为种子萌发和幼苗生长提供必要的物质与能量[19]。 蛋白质除了提供能量外，还具有结构性和渗透调节等功能，因此蛋白质含量与种子萌发之间的关系在不同的作物中结果不一样。对油脂类作物花生[20]和大豆[21]的研究发现，其贮藏蛋白含量高低与种子萌发不相关。但对于淀粉类种子，如小麦[22]、 甜玉米[23]以及高粱[24]等的研究结果均表明，蛋白质含量与种子萌发速率和幼苗生长情况呈正相关，与本研究得出的结果相似。

植物的耐冷性作为数量性状受多种因素的影响，不同种质的某一指标在相同低温胁迫条件下表现不同，难以采用单一指标对植物耐冷性强弱做出判断和比较[25-26]。因此，采用多项耐冷指标进行隶属函数值的综合评价，才能比较准确地反映某一种质的耐冷水平[13]。由于粒用高粱的耐冷性因种质不同而出现差异，本试验确定种子萌发率、幼苗存活率、脂肪和蛋白质含量等4个指标可以用于高粱耐冷性鉴定。因此，采用的综合评价方法可用于评价粒用高粱耐冷性的鉴定。

4 结 论

257份籽粒高粱在10 ℃低温胁迫下种子萌发率达到一级和4 ℃低温胁迫处理7 d后幼苗耐冷等级也达到一级的样品数为7份。相关性分析显示种子萌发率、幼苗存活率、脂肪含量和蛋白质含量等4个指标与耐冷性具有显著相关性，可作为高粱耐冷性鉴定指标。通过隶属函数和聚类分析最终确定7份耐冷高粱种质的耐冷性依次为：GZ 066、GZ 249、GZ 241、GZ 001、GZ 162、GZ 125、GZ 235，并将其分为三类(高强、中强、强)。本研究结果建立了一套高粱耐冷种质鉴定综合评价指标，且筛选出耐冷性较强的种质，为下一步深入研究高粱耐冷性的分子机制奠定了基础。