贵州省水稻耕种区主栽品种镉积累特征分析及低镉积累品种的筛选

张上都,伍 祥,彭 菊,石邦志,蒙秀菲,柏连阳,宋 泽,周乐良

(1.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.贵州省农业科学院水稻研究所，贵阳 550006；3.湖南省农业科学院农业生物技术研究所，长沙 410125；4.贵州省农业科学院农作物品种资源研究所，贵阳 550006)

水稻是贵州省主要的粮食作物，其常年产量占全省粮食总产量的一半[1]。贵州以高原山地居多，而矿产资源富集，导致重金属的自然背景值较高[2-4]，此外，由于近年工矿业快速发展和含磷化肥的大量使用，造成贵州省稻田土壤和农业用水的重金属含量超标[5-8]。镉对生物具有“毒害”作用，其在土壤中具有迁移性强、扩散范围广、存在时间长、治理难度大、生态风险高等特点[9-10]，对该地区的生态系统和农业生产造成不利影响；土壤中的镉通过“土壤-作物-人”的途径，被人们摄入体内，由于镉半衰期较长(一般为30年)，在体内积累，最终危害人体健康[11-12]。

为了缓解稻米镉含量超标的情况，我国已确定了镉在水稻籽粒中积累含量为0.2 mg·kg-1的最大安全阈值。同时也通过修复污染土壤、种植低积累水稻品种两种方法结合，缓解稻米镉超标的风险。但是目前低镉作物选育仍处于起步阶段，所获得的低镉品种仍以筛选为主。水稻品种间存在广泛的镉积累基因型差异，通过对不同品种间镉积累差异的研究，也定位到一些控制稻米镉积累的主效位点及相对应的基因，如位于第7号染色体上的控制稻米镉积累的主效位点[13-14]。本试验拟通过主效位点的分子标记基因型鉴定，对收集的贵州省水稻耕种区的87个主栽品种和稻米镉积累表型鉴定进行筛选，为镉污染水稻栽种区提供低镉品种选择建议。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究的水稻品种主要来源于贵州省水稻耕种区主推品种，个别品种由贵州省内水稻育种家和企业提供，共收集到87份(表1)。

表1 供试种子清单Table 1 List of tested seeds

1.2 试验地点概况

田间试验地点在中国科学院亚热带农业生态研究所的试验田，位于湖南省长沙市长沙县(112°58′42″E, 28°11′49″N)。该试验点属于中亚热带季风湿润气候，年平均气温为 18.6 ℃，常年降雨量为1 152 mm，属于双季稻生产区。土壤总镉含量为1.60 mg·kg-1。

1.3 试验处理与方法

87份测试品种于2019年5月25日播种于试验点的同一地块种植，试验采用完全随机区组设计，3个重复，每个品种栽植4行，每行10窝，2粒谷秧，株行距17 cm×20 cm。田间管理除采用间歇灌溉以最大限度地提高表型差异外，不施底肥，分别在移栽后一周和拔节孕穗期进行追肥，其他遵循常规田间一致。当年10月13日收获其籽粒用于稻米镉积累表型考察。

2 检测项目及方法

2.1 土壤理化性质

在水稻移栽前取稻田耕作层 0～20 cm的土壤，进行理化性质检测。先将土样风干，去除石头和动植物残渣，再研碎后过 100 目标准筛，密封装置备用。为保证数据的准确性，每个样品重复测定 3 次。使用原子分光光度法[15]测定总镉为1.60 mg·kg-1，使用电位法[16]测定pH值为5.4。

2.2 分子标记

选取每份品种的叶片，利用CTAB法抽提样品基因组DNA，用于低镉累积的分子标记检测。4个低镉位点[17-18]分别是qCd7.1、qCd7.2、qCd2和qCd11，根据先前的研究结果，筛选与这4个位点所连锁的STS标记。

2.3 糙米中镉含量的测定

水稻成熟后，使用聚氨酯辊的砻谷机对稻谷进行脱壳，防止金属污染。采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)[19]测定糙米中的镉含量，每个样品进行两次平行测定。

3 数据处理

数据采用 Microsoft Excel 2016软件和SPSS软件进行统计分析，采用 Duncan 新复极差法进行多重比较显著检验(p<0.05)，利用Student’s t test软件进行分组差异性检测(p<0.05)，最终用GraphPad Prism 8软件或Excel 2016软件进行图形化处理。

4 结果与分析

4.1 87份测试品种的稻米糙米中镉含量

87份水稻品种镉含量均值排序如图1所示。其镉含量的表型连续分布，含量介于1.112～2.921 mg·kg-1之间，变异系数达18.7%，表明87份测试品种间的稻米镉积累表型差异显著(表2)。3个重复之间相关系数大于0.703(p<0.01)，说明实验数据间重复性较好；此外通过方差分析发现，品种间的基因型差异决定了87份材料稻米镉表型差异的78.1%，达极显著水平(p<0.001)；尽管土壤镉含量不均一等环境因素也显著影响了表型变异，但其对87份材料间的表型差异解释率只有1.25%(p=0.006)。以上结果说明，本试验所涉及的品种间的稻米镉积累变异以基因型差异为主，而非环境因素(表3)，通过比较不同材料间的稻米镉积累差异，能有效地选择出具有稳定遗传差异特征的品种。

表2 87份品种在4个低镉位点上的基因型与其镉含量Table 2 Comparasion of genotypes at four low cadmium loci and cadmium content in 87 cultivars

表3 87份品种稻米镉积累表型变异的方差分析Table 3 Variance analysis of phenotypic variation of cadmium accumulation in 87 rice varieties

根据这些材料的稻米镉积累特征进行了排序，选出镉积累相对较低的材料，以87份品种中稻米镉含量最低的品种红黄白(1.112 mg·kg-1)作为参考品种，利用多重比较(Duncan’s test)进行低镉品种筛选。发现存在31个品种和最低镉积累品种红黄白在稻米镉含量上无显著差异(p>0.05)，因此将这32个品种作为筛选出的稻米镉低积累品种(表4)。由于试验田间管理操作时利用了干湿交替的水分管理措施，因此土壤镉的植物有效性被大大增强，导致87份材料的籽粒中含镉量均较高。

表4 稻米镉含量相对较低的前50份材料的多重比较Table 4 Multiple comparisons of the first 50 rice varieties with low cadmium content

4.2 87份材料中的低镉位点基因分析

利用已知的4个稻米镉积累位点的分子标记[17-18]，(p<0.05)。

对87份水稻品种进行基因型鉴定，将供试品种分成6类：第一类含有3个位点以上的材料；第二类含有任何两个位点的材料；第三类仅含有qCd7.1的材料；第四类仅含有qCd7.2的材料；第五类仅含有qCd11的材料；第六类不含任何位点的材料(图1 A)。其中，含有多个低镉位点的材料共7份，占全部材料的8.05%，含有1个位点的材料共29份，占全部材料的33.3%，而不含低镉位点的材料占58.6%(表1)。

结合供试品种的稻米镉含量表型和基因型差异，发现以下几个特点：首先，在目前的主栽品种中，把含有低镉位点整合在同一个品种中的数量较少；其次，含有2个位点以上的品种籽粒镉含量显著低于不含低镉位点的品种(p<0.05；图1 B)。最后，本试验所涉及的4个位点中，qCd7.1的籽粒镉积累降低效果最好，优于qCd7.2和qCd11。含有qCd7.1的材料其稻米镉含量显著低于不含有任何低镉位点的材料(p<0.05；图1 B；1 C)；而含有qCd11或qCd7.2的材料在所试材料中不存在显著性差异(p>0.05；图1 B)。为了进一步分析qCd7.1的降镉效应，分析了含有低镉位点等位基因(qCd7.1-A/H)的品种其籽粒镉含量在全部测试品种的分布情况，发现它们主要分布在所试87份品种中稻米镉含量相对较低的材料中(表4，图1 D)。由此可以看出，含有低镉位点qCd7.1的品种籽粒中的镉含量表现较低，该类品种其籽粒在同样的土壤镉环境条件下，镉在稻米中的积累能力相对较弱，可以为低镉品种选育提供分子辅助。

5 讨 论

水稻品种进行镉累积是一个复杂的生化反应，受生长发育的外在环境和其本身具备的低镉调控遗传内在基因的共同调控[20]。本次实验进行的低镉水稻品种筛选，与过去有以下几点区别：一是过去研究在筛选水稻种质资源、常规稻、杂交种[21-23]以及杂交亲本[24-25]的时候，通常采用在镉污染稻田或者盆栽实验，以各个生育期的表型作为依据，即单一的考虑水稻的根系、茎叶和籽粒以及亚细胞中镉含量进行低镉或高镉材料的判断准则，而本实验是以稻米中镉含量的田间表型结合分子标记的低镉位点为筛选依据同步进行考核；二是过去研究采用一系列农艺措施降低有效镉的活性以及茎叶中镉向籽粒的转运，包括长期淹水灌溉[26-28]、施用生石灰[29-30]及土壤调理剂[31]、配合喷施叶面阻控剂如硅[33]、硒[34]等微肥，而本试验采用间歇灌溉是为了激发所有材料吸镉的最大潜力，以期筛选出既具备低镉位点又能够在镉污染稻田中进行低镉累积表型的品种，在生产中辅助各项农艺措施，使其生产出的稻米中镉含量在食用的安全标准之内。对此，可以借鉴湖南省在镉污染治理方面采用“VIP+n”措施[35-36]来降低籽粒中的镉含量。根据本试验的结果可知，尽管所有供试品种籽粒中的镉含量均超标，但是含有低镉位点的水稻品种总体情况比没有低镉位点的品种含量低，如果田间管理能够采用降镉治理的栽培措施，如施用生石灰、长期淹水、喷施叶面阻隔剂等能够降低籽粒中的镉含量。

注：A为87份品种按照4个低镉等位的分类；B为6个类别间的稻米镉含量比较；C为qCd7.1等位间的稻米镉含量比较；D为含qCd7.1低镉等位基因型(A/H)的品种在全部材料稻米镉含量表现的分布。图1 87份测试品种在4个稻米镉低积累位点中的稻米镉积累特征分析Fig.1 Analysis of cadmium accumulation characteristics of 87 cultivars at four cadmium low accumulation sites in rice

根据本试验品种间低镉位点基因型鉴定的结果可知，目前贵州省推广的水稻品种中，含低镉基因的品种较少，主要原因有以下两点：一是贵州省稻作区受到镉污染的水田面积较小，育种家尚未或较少地在实际育种中进行低镉性状的选育；二是本试验所涉及的87份品种只有约1/3的品种含有低镉位点，其中含有qCd7.1位点的品种则更少，只占10.3%。而在87份水稻品种镉积累特征考察中发现，存在一些镉含量较低但不含任何低镉位点的品种，如红黄白、白麻香粘等(表1，表2)，可能因供试品种数量和实验重复性的关系，不能以此来判定三系与两系、常规稻与杂交稻、白米与特色米等各自之间在低镉累积方面哪个更具优势，也说明目前仍存在大量的稻米镉积累遗传变异尚未被发现。因此需要在未来的水稻品种选育过程中加大对已知低镉位点的利用，尤其是qCd7.1，在具体的镉积累特征鉴定中筛选具有镉积累特征差异的品种，发掘新的位点从而更好的用于低镉品种选育。

6 结 论

本试验所涉及的品种利用了干湿交替水分管理措施，因此土壤镉的植物有效性被大大增强，结果显示，稻米镉积累变异以基因型差异为主，而非环境因素。通过比较不同材料间的稻米镉积累差异，能有效地选择出具有稳定遗传差异特征的品种。并且发现含有低镉位点qCd7.1的品种籽粒中镉含量表现较低，该类品种的籽粒在同样的土壤镉环境条件下，镉在稻米中的积累能力相对较弱，可以为低镉品种选育提供分子辅助。