老年不稳定型心绞痛患者外周血ROCK1水平与血管内皮功能及颈动脉内膜中膜厚度的相关性

方 烨 邹 琳 李 潇 林 静 何 威

(中国人民解放军中部战区总医院干部病房三科，武汉 430000)

不稳定型心绞痛(unstable angina,UA)是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)的一种类型，该病预后不良，可引发急性心肌梗死，严重的情况会导致残疾甚至心脏死亡[1]。因受年龄、生活环境及工作压力等因素的影响，UA的发生率正逐年升高，而我国人口老龄化趋势明显，老年UA患者更加值得关注[2-3]。循证经验[4]表明，尽早确定病情范围并进行指导治疗是UA预后的关键，但临床上目前所采用的冠状动脉造影价格昂贵，且具有一定创伤，故借助分子生物技术预测UA病变成为研究热点[5-6]。RhoA是小分析G蛋白Rho家族中的亚型，而Rho激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)是最早发现的RhoA下游靶点，由ROCK1亚型和RhoA形成的RhoA/ROCK1信号通路，可调节血管平滑肌的收缩，影响细胞增殖和迁移，在各类血管相关疾病中起重要作用[7-8]。有研究[9-10]显示，ROCK1水平升高可导致RhoA/ROCK1通路激活，与高血压患者颈动脉内膜中膜厚度(intima-media thickness, IMT)的增厚关系密切，而IMT增厚是心血管风险增加的常见表现，提示ROCK1可能与老年UA病变程度存在一定相关性，但鲜见相关报道。现通过检测老年UA患者外周血ROCK1水平，分析ROCK1与该类患者血管内皮功能及IMT的相关性，以期找到影响UA预后的潜在标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2018年6月至2020年6月期间就诊于中国人民解放军中部战区总医院心内科的疑似冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)的老年病例126例。其中，经冠状动脉造影检查阳性且诊断为UA的患者74例为病例组；冠状动脉造影阴性且不存在UA的患者52例为对照组。入选标准：①年龄60周岁以上；②符合《不稳定型心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》[11]诊断标准：造影结果显示,单支或多支病变狭窄超过50%则为阳性。 排除标准：①器官功能严重不全者；②有近期手术史或炎症损伤者；③患有恶性肿瘤、感染性疾病、瓣膜性心脏病及陈旧性心肌梗死疾病者；④难治性高血压患者。研究获医院伦理委员会审批(批号：2018-KY-121)，获得了所有患者的书面同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集

收集并记录所有患者入院后的性别、年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、血压、既往史、吸烟史等信息。

1.2.2 血液指标检测

所有患者禁食至少8 h，清晨空腹条件下，采集所有患者静脉血，检测患者总胆固醇(total cholesterol,TC)、乙酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、尿酸、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)等指标。

1.2.3 外周血ROCK1水平检测[9]

清晨空腹条件下，采集所有患者外周静脉血5 mL，室温条件下静置约1 h，转速3 000 r/min离心10 min，取上清液，待测。用移液器分别吸取标准品和待测血清各0.1 mL加入酶标板；各孔中再分别加入50 μL酶标液，于37 ℃孵育作用1 h，清洗酶标板后，加入显色剂A、B各50 μL，25 ℃条件下避光反应10 min，加入适量终止液使反应停止。设定波长450 nm，进行吸光度(absorption,A)测定。采用标准曲线法计算各孔A值，并通过4参数Logistic曲线拟合进行ROCK1水平计算。

1.2.4 血管内皮功能测定

以血管内径变化率(flow mediated dilation, FMD)评估患者血管内皮功能，应用BLS-820全数字超声诊断系统(徐州贝尔斯电子科技有限公司)进行测定。患者保持仰卧姿势，取肱动脉(位于肘关节2～15 cm处)纵切面进行测定。首先进行静息状态下的内径基础值(D0)测定，然后通过血压计袖带束缚加压至280～300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，并借助止血钳控制进气管压力，保持该压力后约5 min放气，60～90 s内完成反应性充血后内径值(D1)的测定，重复测定3个周期，取其平均值。FMD=(D1-D0)/D0×100%。

1.2.5 IMT的测定

采用BLS-820全数字超声诊断系统(徐州贝尔斯电子科技有限公司)测定IMT，操作者必须为培训合格的专业医师。根据《血管超声检查指南》[11]对IMT分级：IMT<1 mm为正常，1 mm≤IMT<1.5 mm为增厚，IMT≥1.5 mm说明形成斑块。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料比较

与对照组相比，UA组吸烟比例及HbA1c更高，差异具有统计学意义(P<0.05)；两组患者的性别、年龄、BMI、是否患糖尿病、高血压及血脂相关指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 两组病例一般资料比较

2.2 两组患者FMD、IMT及ROCK1水平比较

与对照组相比，UA组患者的FMD水平更低，而IMT及ROCK1水平更高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组患者FMD、IMT及ROCK1水平比较

2.3 多元线性回归分析

以ROCK1作为因变量(Y)，自变量为单因素分析中P<0.2的吸烟(X1)、高血压(X2)、HbA1c(X3)、FMD(X4)及IMT(X5)，在校正年龄、BMI的条件下，采用多元线性回归分析。结果FMD及IMT纳入回归方程，与ROCK1的关系具有统计学意义(P<0.05)，所得回归方程为：Y=0.512X5-0.462X4+2.106，提示FMD与ROCK1呈负相关关系，IMT与ROCK1呈正相关关系，详见表3。

表3 多元线性回归分析

3 讨论

UA是ACS最常见的一种，发病机制极其复杂，易损斑块的形成是其最关键诱因，该类斑块相对不稳定，易于发生破裂和糜烂并形成血栓，加上血管痉挛和微血管栓塞等因素共同作用，心肌供氧不足，最终导致出现ACS[12]。其病理表现有：斑块内发生出血，纤维帽出现裂隙，血小板聚集于表面并形成血栓：一方面，刺激炎性相关因子产生；另一方面，刺激冠状动脉血管产生痉挛，导致心肌局部血流明显不足，严重者甚至出现血液断流；此外，血栓还可能脱落并阻断血流，当其大小只能阻塞部分冠状动脉时，即可引发UA发生，还能导致出现动脉粥样硬化[13]。血管内皮是阻隔管壁和血流的屏障，在心血管系统的平衡中不可或缺，而UA的发生，会破坏血管稳定，进而影响血管内皮功能[14]；另外，血管早期病变出现的易损斑块，常导致IMT增厚，而颈动脉连接各大血管，故临床常通过测定IMT来反映全身血管情况[15]。故对老年UA患者血管内皮功能及IMT进行测定，可一定程度反映其病变情况。

ROCK1由1 354个氨基酸组成，含有一个N端定位的激酶结构域，一个盘绕的区域，然后是一个Rho结合结构域，在血细胞和胸腺中有较强表达[16]。细胞发生凋亡早期伴随半胱氨酸蛋白酶(caspase)的激活，导致许多蛋白质发生裂解，其中就包括ROCK1[16]。ROCK1被caspase-3在一个保守的DETD1113/G序列上裂解，从而消除自身抑制性C-末端区域，从而产生具有活性的ROCK1，这导致了肌动球蛋白依赖性的膜泡，其中包含碎片DNA。在心力衰竭患者的心脏组织中，可检测到ROCK1断裂片段和活性caspase-3，但在心脏正常的患者心肌组织中几乎未检测到；在动物和细胞模型中，ROCK1的下调降低了心肌细胞凋亡，促使caspase-3的激活[17]。目前，已可见ROCK1在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化等疾病研究中的报道[9]，而UA是最常见的心血管疾病之一，ROCK1有望在该疾病领域发挥应用价值。本研究中ROCK1在老年UA患者外周血中高表达，提示ROCK1可能对UA存在一定影响，可能与RhoA/ROCK1信号通路相关。

RhoA/ROCK1信号通路的研究早已应用于心血管领域，该通路对于血管内皮功能的影响较大。李立杰等[18]进行了动物实验，发现RhoA/ROCK1信号通路的蛋白表达受到抑制后，可缓解高血压对大鼠的血管内皮损伤。生理状态下，ROCK1可调节血管内皮细胞的通透性，以确保血管内皮屏障完整；还可促进一氧化氮的生成，使血管扩张，加速单核细胞转移[19]。本研究中，老年UA患者具有较低的FMD水平，存在明显的血管内皮功能异常，说明ROCK1可反映老年UA患者血管内皮功能病变情况。可能是UA病变状态下的血管内皮发生损伤，屏障作用不再稳定，ROCK1被激活并抑制了RhoA/ROCK1信号通路蛋白表达，血管内皮通透性受到抑制，更易于形成斑块。

既往研究[20]已证明IMT与心脑血管疾病中斑块形成有关，IMT越厚，提示病变程度越重；IMT每增加0.1 mm，心肌梗死的风险可能增加10%～15%，并且未来发生卒中的风险也会相应增加。本研究中，UA组患者的IMT水平显著高于对照组，提示老年UA患者存在明显的IMT增厚情况，这与ACS早期会有IMT增厚的临床表现相符。国内外均有研究[20-21]报道IMT增厚与血管内皮功能有关，内皮功能障碍可能是一种比颈动脉IMT增厚更早的血管现象。本研究中，多元线性回归分析显示，ROCK1与FMD及IMT有独立相关性，提示随着UA患者IMT增厚及斑块形成，血管内皮功能进一步受损，动脉粥样硬化进程加深。可见，血管内皮功能障碍和IMT增厚对UA病程具有协同作用，提示临床可通过检测外周血ROCK1，及早识别高风险患者并采取干预措施。

综上，老年UA患者的外周血ROCK1与其血管内皮功能及IMT存在一定相关性，有望成为预测老年UA患者预后的潜在标志物。但由于本研究纳入病例较少，且未进行ROCK1与UA患者预后相关方面的考察，存在一定的不足；关于ROCK1与UA的相关研究太少，其具体机制有待更进一步研究予以确认。