细胞周期蛋白依赖性激酶12、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1在胃癌组织中的表达及临床意义

李世森，杜昆利，刘小娟

空军军医大学第一附属医院消化外科，西安 710032

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，是全球第4大常见肿瘤，其发病率和病死率均逐年上升，并趋于年轻化，严重危害患者的健康。中国是胃癌高发地区，每年胃癌新发例数和病死例数均居全球前列，因此有必要深入探讨胃癌发生机制，探寻可以早期诊断预测胃癌发生发展的生物学指标，具有重要的临床实际意义。细胞周期蛋白依赖性激酶12（cyclin dependent kinase 12，CDK12）属于CDK的一种，在调控DNA损伤和应激损伤的细胞应答基因转录方面发挥特定作用。近年来关于CDK12过表达在多种恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺导管癌等中已有报道。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]基因产物是与肿瘤风险相关的重要蛋白，可催化单链断裂的碱基切除修复步骤，在人类癌变DNA修复系统和维持基因组的完整性方面起关键作用。早期研究已报道

PARP1

基因多态性与胃癌易感性有关，同时携带

PARP

-1940Lys/Arg和

PARP

-1762Ala/Ala+Val/Ala基因型的个体患胃癌的风险是野生型携带者的4.2倍，但近年来关于PARP1在胃癌患者中的表达研究少见报道。因此，本研究通过检测胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中CDK12、PARP1的表达情况，分析其表达水平与患者临床特征的关系，探究其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2013年3月至2015年3月于空军军医大学第一附属医院行手术切除治疗的76例胃癌患者为研究对象，取其胃癌组织标本及相应癌旁正常胃黏膜组织标本（距离肿瘤组织＞5 cm）。纳入标准：①年龄≥18岁，均经病理检查证实为胃癌；②均为首次治疗，接受胃癌根治术，且术前未行放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗；③临床资料及随访资料完整。排除标准：①合并其他原发肿瘤；②不配合随访。本研究获得医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个有效的肿瘤数据在线分析和挖掘的网站，GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一个由北京大学开发的数据库，二者都是基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据分析和可视化的网站，可帮助医学科研人员对相关肿瘤基因进行生物标志物鉴定、表达图谱分析、生存分析等。本研究基于上述两个数据库，对

CDK12

、

PARP1

mRNA在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的表达差异进行比较。

1.2.2 免疫组化法检测胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中CDK12、PARP 1蛋白表达将石蜡组织标本以4 μm切片，进行脱蜡、水化处理，采取免疫组化EnVision两步染色法检测CDK12、PARP1蛋白表达情况，方法步骤按试剂盒说明书操作。一抗采用兔抗人CDK12多克隆抗体、兔抗人PARP1多克隆抗体（均购自美国Sigma公司），二抗采用羊抗兔CDK12、PARP1（均购自美国Abcam公司），二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。以已知阳性切片标本为阳性对照，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作为阴性对照。结果判定根据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分。①按染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，黄色或黄棕色为2分，棕褐色为3分；②按阳性细胞所占比例评分：无阳性细胞为0分，＜25%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。两种评分方法得分的乘积为最终结果，以最终结果＞2分为阳性表达（+），≤2分为阴性表达（-）。

1.3 随访观察

所有胃癌患者术后均行电话随访或门诊随访，随访自手术后第1个月起，截至2020年3月或患者死亡（8～60个月）。第1～2年每1～3个月随访一次，第3～4年每6个月随访一次，之后每年随访一次。观察胃癌患者在随访结束时及随访过程中的生存状况，分析CDK12、PARP1蛋白表达情况与患者生存的关系。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 数据库中正常胃黏膜组织和胃癌组织中CDK12、PARP 1 mRNA表达情况的比较

Ualcan数据库显示，胃癌组织（

n

=415）中

CDK12

mRNA表达水平为19.17（12.47，24.73），高于正常胃黏膜组织（

n

=34）的 9.41（7.52，11.78），差异有统计学意义（

Z

=10.265，

P

＜0.05）；胃癌组织（

n

=415）中

PARP1

mRNA表达水平为65.37（50.09，88.61），高于正常胃黏膜组织（

n

=34）的35.63（28.15，42.20），差异有统计学意义（

Z

=17.923，

P

＜0.05）。GEPIA数据库显示，胃癌组织（

n

=408）中

CDK12

、

PARP1

mRNA表达水平分别为（4.17±0.63）、（5.92±0.78），均高于正常胃黏膜组织（

n

=211）的（3.12±0.42）、（4.23±0.59），差异均有统计学意义（

t

=21.827、27.643，

P

＜0.05）。胃癌组织中

CDK12

mRNA和

PARP1

mRNA水平呈正相关（

r

=0.15，

P

=0.003）。

2.2 免疫组化法分析胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中CDK12和PARP 1蛋白表达情况的比较

免疫组化结果显示，CDK12在细胞质和细胞核中均有表达，其中细胞核占多数，PARP1主要定位于细胞核（图1）。胃癌组织中CDK12、PARP1阳性表达率分别为81.58%（62/76）、85.53%（65/76），均明显高于癌旁正常胃黏膜组织中的17.11%（13/76）、21.05%（16/76），差异均有统计学意义（

χ

=63.195、63.459，

P

＜0.01）。

图1 胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中CDK12和PARP 1蛋白表达情况（免疫组化法，×400）

2.3 不同临床特征胃癌患者的胃癌组织中CDK12和PARP 1蛋白表达情况的比较

不同年龄、性别、肿瘤大小的胃癌患者的胃癌组织中CDK12和PARP1蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。不同TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况的胃癌患者的胃癌组织中CDK12和PARP1蛋白表达情况比较，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征胃癌患者的胃癌组织中CDK12和PARP 1蛋白表达情况的比较（ n=76）

2.4 生存分析

生存分析结果显示，CDK12蛋白阳性表达胃癌患者5年生存率为30.65%（19/62），明显低于CDK12蛋白阴性表达患者的78.57%（11/14），差异有统计学意义（

χ

=10.980，

P

=0.001）；PARP1蛋白阳性表达患者5年生存率为32.31%（21/65），明显低于PARP1蛋白阴性表达患者的81.82%（9/11），差异有统计学意义（

χ

=7.691，

P

=0.006）。（图2、图3）

图2 CDK12蛋白阳性表达（ n=62）与CDK12蛋白阴性表达（ n=14）胃癌患者的生存曲线

图3 PARP 1蛋白阳性表达（ n=65）与PARP 1蛋白阴性表达（ n=11）胃癌患者的生存曲线

2.5 胃癌患者预后影响因素的Cox回归分析

以胃癌患者预后情况为因变量（生存=0，死亡=1），以年龄（＜60岁=0，≥60岁=1）、性别（女=0，男=1）、肿瘤大小（＜5.0 cm=0，≥5.0 cm=，）、CDK12蛋白表达（阴性=0，阳性=1）、PARP1蛋白表达（阴性=0，阳性=1）、TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、分化程度（低分化=1，高/中分化=0）、淋巴结转移（无=0，有=1）为自变量进行单因素及多因素Cox回归分析，结果显示，CDK12蛋白阳性表达、PARP1蛋白阳性表达、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、淋巴结转移是影响胃癌患者预后的独立危险因素（

P

＜0.01）。（表2、表3）

表2 胃癌患者预后影响因素的单因素Cox回归分析

表3 胃癌患者预后影响因素的多因素Cox回归分析

3 讨论

胃癌的早期症状不易被发现，当出现临床症状时，多数已发展为中后期，其难治性主要与肿瘤细胞的转移、侵袭作用有关。细胞的生命开始于细胞周期，肿瘤细胞亦然，细胞周期的正常运行依赖于精确的调控机制。目前已发现的参与细胞周期调控的分子有3大类：细胞周期蛋白、CDK以及CDK抑制剂，其中CDK是调控的核心。大量研究发现，有90%左右的肿瘤存在CDK活性增强，CDK调控异常可作为肿瘤发生的标志。研究发现，CDK12定位于人体染色体17p12上，包含一个相对保守的激酶域（kinase domain，KD），KD可介导RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化。CDK12在人体内普遍表达，其中生殖组织、内分泌组织、骨髓、脾脏等组织器官中CDK表达较高，且主要表达于细胞核。本研究结果显示，CDK12在胃癌组织中主要定位于细胞核，其阳性表达率明显高于癌旁正常胃黏膜组织，表明CDK12在胃癌组织中过表达，可能发挥致癌基因作用。研究发现，CDK12/cyclin K复合物在Ser2位点磷酸化RNA聚合酶Ⅱ，是转录开始到延伸的关键环节；敲除

CDK12

或

cyclin K

导致细胞对DNA损伤反应敏感，提示CDK12/cyclin K在DNA损伤修复（DNA damage repair，DDR）及损伤应答中起重要调控作用。本研究结果显示，CDK12蛋白表达水平与胃癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，与Ualcan、GEPIA数据库中

CDK12

mRNA表达趋势一致，然而未观察到CDK12蛋白表达与胃癌患者年龄、性别的相关性，可能基因与蛋白水平存在一定差异。C-C趋化因子配体21（C-C motif chemokine ligand 21，CCL21）可能是 CDK12的下游效应基因，CCL21可调节肿瘤细胞和免疫细胞生物学功能，诱导免疫应答激活，与肿瘤浸润和淋巴结转移有关，推测CDK12可能通过CDK12/CCL21通路参与胃癌肿瘤细胞的恶性功能调节和免疫微环境调节，影响胃癌肿瘤细胞的增殖分化、侵袭转移过程，具体作用机制有待进一步研究。PARP1是PARP家族表达最丰富、研究最多的一种，由N末端的DNA结合域（DNA-binding domain，DBD）、中间的自身修饰结构域（self modification domain，SMD）和C末端的催化结构域（catalytic central domain，CCD）组成，PARP1通过DBD中的2个锌指结构识别单链或双链断裂DNA并与之结合发挥修复作用。生理状态下的PARP1活性较低，当接收到机体应激信号时可引起生物活性增加，感知并转导不同信号，通过磷酸化、乙酰化、泛素化或糖基化修饰作用与相应靶蛋白结合，参与DNA修复、基因转录、基因组完整性维持、细胞分裂凋亡、炎性因子表达等生理过程。国内学者张顶顶等研究报道，PARP1在激活后，与DNA结合可调控肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子表达，通过上调血管壁外膜炎症反应参与调控颅内动脉瘤的发生、发展及破裂，揭示了PARP1与炎症因子的作用关系。另有研究指出，PARP1过度激活会导致染色体DNA大量断裂，并触发一种固有的依赖于PARP1的细胞死亡程序，该程序广泛存在于多种器官系统中。本研究结果显示，PARP1主要表达于胃癌组织细胞的细胞核中，其在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常胃黏膜组织，推测胃癌组织及细胞中PARP1细胞死亡程序被过度激活，DNA遭到大量破坏，细胞周期调控异常，使得肿瘤细胞过度增殖，导致患者病情恶化。另外，PARP1蛋白表达与胃癌组织分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关，表明PARP1可能参与胃癌细胞侵袭、转移过程。进一步研究发现，胃癌组织中CDK12和PARP1表达呈正相关，与GEPIA数据库中

CDK12

mRNA和

PARP1

mRNA在胃癌组织中表达趋势一致，推测二者可能发挥协同作用调控DNA的转录，参与胃癌的发生发展进程，具体作用机制尚不清楚。生存分析结果显示，CDK12、PARP1蛋白阳性表达胃癌患者5年生存率均明显低于阴性表达患者，Cox分析显示CDK12蛋白、PARP1蛋白阳性表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素，表明CDK12、PARP1表达与胃癌患者生存预后有关，可能作为提示胃癌患者预后不良的潜在生物标志物。有研究显示，PARP抑制剂对治疗

CDK12

缺失患者具有重要意义，或可对临床治疗提供重要参考依据，因此关于两者的具体作用机制有待后续进一步研究。

综上所述，CDK12、PARP1蛋白在胃癌组织中呈高表达，其表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移及不良预后有关，二者可能共同作用在基因转录水平参与胃癌的发生发展进程。