青赤散灌肠对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜通透性的改善作用及其机制

马玲玲，冀建斌

天津中医药大学第一附属医院消化科，天津300192

溃疡性结肠炎（UC）是一种特发性的慢性结肠黏膜炎症病变，临床主要表现为腹痛、腹泻和黏液脓血便，主要侵犯结直肠的黏膜与黏膜下层［1］。相关研究［2］表明，UC是由于多种因素的相互作用而最终导致肠道黏膜慢性炎症的发生。其发病机制与肠黏膜屏障功能受损有一定的相关性，环境因素、遗传易感性、免疫反应异常、感染以及精神心理状态也被认为与UC的病理和生理具有很大的关系，越来越多的研究［3］表明，肠道黏膜屏障的解剖基础源于黏膜机械屏障，由肠黏膜表面的黏液层、肠黏膜上皮细胞及细胞间紧密连接、上皮基底膜、黏膜下固有层等构成，有抵御较强的刺激和细菌侵犯的能力。大量研究［4］表明，中医药能通过各种不同的作用机制对肠黏膜屏障起保护作用，相比西药具有不良反应少、疗效好的特点，青赤散由赤石脂、炉甘石、苦参、黄柏、青黛、三七粉、白及和儿茶组成［5］，具有化瘀止血、清热祛湿、敛疮生肌的功效。临床研究［6］显示，青赤散灌肠在UC的治疗中取得了非常好的效果，但其药理机制尚不明确。2017年6月—2020年12月，本研究观察了青赤散灌肠对UC小鼠肠黏膜通透性的改善作用，并探讨其机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 小鼠、青赤散及试剂 雄性C57BL/6 J小鼠50只，鼠龄7～8周，体质量21～25 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证编号为SCXK（京）2020-0058。小鼠在无病原体环境中由专人饲养，室温22～24℃，光照和黑暗循环12 h，随意饮食和饮水。青赤散组成药物：赤石脂60 g、炉甘石30 g、黄柏30 g、苦参30 g、青黛10 g、儿茶6 g、三七粉6 g、白及颗粒9 g，购自江阴天江药业有限公司。Notch、分裂相关增强子-1（Hes1）、无调同源物1（ATOH1）一抗购自北京索来宝生物科技有限公司，结肠组织黏蛋白-2（MUC2）一抗购自杭州吉诺生物公司。

1.2 青赤散灌肠方剂制备 将赤石脂、黄柏、苦参、炉甘石、青黛置于烧瓶中，将药物泡制60 min后，使用数显控温加热套加热，水沸腾后再煎煮60 min，去渣，将白及颗粒和三七粉调成汤剂，旋转蒸发器浓缩药物后，分装到1.5 mL EP管中，放于4℃冰箱中备用，每次使用前加热至37℃。

1.3 动物分组和青赤散灌肠 50只雄性C57BL/6 J小鼠随机分为对照组、模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组，每组10只。对照组每天自由饮用双蒸水，其他组小鼠自由饮用3%的葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液7 d建立UC小鼠模型［7］，建模成功后无小鼠死亡。在建模成功后的第2天进行药物干预，按照60 kg/200 g人鼠转换系数W=6.25，计算得出青赤散灌肠浓度为24.15 g/kg，每天1次，连续7 d。青赤散高剂量组每天给予青赤散24.15 g/kg灌肠治疗，青赤散中剂量组每天给予青赤散12.08 g/kg灌肠治疗，青赤散低剂量组每天给予青赤散6.04 g/kg灌肠治疗，对照组和模型组按照5 mL/kg给予0.9%NaCL灌肠。

1.4 各组小鼠肠黏膜通透性观察 采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran）示踪法［9］。取灌肠治疗7 d后的各组小鼠，禁食4 h后给予FITC-Dextran 4000（600 mg/kg）灌胃，灌胃4 h后，采集全血，离心处理，使用荧光分光光度计测定其荧光强度，激发光波长为490 nm，发射波长为520 nm，制作标准曲线并计算小鼠血浆中FITC-D含量，以小鼠血浆中FITC-D含量表示小鼠肠黏膜通透性。

1.5 各组小鼠体质量变化率测算和结肠长度测量 从造模后第1天开始，观察并记录各组小鼠的体质量，计算体质量变化率。体质量变化率=（实验开始后体质量—实验开始时体质量）/实验开始时体质量×100%。实验第7天脱颈处死小鼠，处死前12 h禁食禁水，小鼠处死后，立即取出结肠组织，测量结肠长度。

1.6 各组小鼠结肠组织病理学观察和评分 采用HE染色法。小鼠处死后分离结肠组织，放入4%的多聚甲醛固定，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4μm切片后进行苏木素—伊红（HE）染色，具体操作步骤参照HE染色参考文献［8］，染色后再显微镜下观察小鼠结肠组织的病理学变化，并参照文献［9］对小鼠进行组织病理评分：0分为无明显损伤；1分为存在少量淋巴细胞浸润，基底部1/3隐窝破坏；2分为淋巴细胞浸润水平偏高，基底部2/3隐窝处破坏；3分为淋巴细胞浸润程度较高，损伤黏膜以及黏膜下层，仅表面上皮完整；4分为淋巴细胞浸润程度显著，全部隐窝和上皮破坏。

1.7 各组小鼠结肠组织中炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA检测 采用qRT-PCR法。取分离的结肠组织剪成小块，采用TRIzol法提取总RNA，反转录成cDNA，按照试剂说明书进行qRT-PCR检测。TNF-αmRNA上游引物为5′-GAGTTCATTCCCTCTGGGGC-3′，下游引物 为5′-TGAAGGCAGAGTGGCTTGAG-3′；MCP-1 mRNA上游引物 为5′-GCCCCATTCTCCTCCAGTTA-3′，下游引物 为5′-CCATGGGGGAGAACTTAGCA-3′；IL-1βmRNA上游引物为5′-TGGGAGAAACCCTGAAAGCAG-3′，下游 引 物 为5′-GAATTCACGGACCCCACAAG-3′；TCACGGA作为内参，上游引物为5′-CCTGAAAGCAGGGTTGTGGG-3′，下 游 引 物 为5′-GAATTCACGGACCCCACAAG-3′。qRT-PCR反应条件为95℃、20 min，90℃30 s、72℃30 s，72℃、5 min，循环次数为45次。以2-ΔΔCt表示小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA的相对表达量。

1.8 各组小鼠结肠组织中Notch信号通路相关蛋白Notch、Hes1、ATOH1、MUC2检测 采用Western Blotting法。取分离的结肠组织，剪成小块称重，每10 mg组织中加入100 g裂解液和1μL蛋白酶抑制剂，匀浆至无块状，移入1.5 mL EP管中，16 000 r/min低温离心20 min，采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，在10%SDS-PAGE电泳、转膜，然后用5%脱脂乳封闭，4℃条件下分别加入Notch、Hes1、ATOH1、MUC2一抗，孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室温下孵育1 h，最后采用增强化学发光（ECL）试剂检测小鼠结肠组织中Notch信号通路相关蛋白Notch、Hes1、ATOH1和MUC2。

1.9 各组小鼠结肠组织中杯状细胞数测算 采用PAS染色法。取分离的结肠组织约为0.5 cm左右，放入4%的多聚甲醛中固定，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4μm切片，将切片浸入1%过碘酸8 min，采用PAS液染色10 min，偏重亚硫酸钠洗液5 min后冲洗，苏木素染核、分化、返蓝，透明、封片后，在400倍显微镜下，每张切片选择10个视野，计数每个视野中的杯状细胞数，取平均值。

1.10 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肠黏膜通透性比较 对照组、模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠血浆中FITC-D含量分别为（0.47±0.13）、（2.51±0.76）、（1.93±0.34）、（1.26±0.19）、（0.72±0.16）μg/mL，其中模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠血浆中FITC-D含量与对照组相比显著升高（P均<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠血浆中FITC-D含量与模型组相比显著降低（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠血浆中FITC-D含量与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著降低（P均<0.05）。

2.2 各组小鼠体质量变化率和结肠长度比较 造模后各组小鼠体质量变化率比较见表1。由表1可知，各组小鼠在第1～3天的体质量变化率无显著差异（P均>0.05），模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组在第4～7天的体质量变化率与对照组相比显著降低（P均<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组在第4～7天的体质量变化率与模型组相比明显升高（P均<0.05），青赤散高剂量组在第4～7天的体质量变化率与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著升高（P均<0.05）。对照组、模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠长度分别为（8.09±0.65）、（5.93±0.46）、（6.44±0.57）、（7.63±0.61）、（7.97±0.63）cm，其中模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠长度与对照组相比显著变短（P<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠长度与模型组相比显著变长（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠结肠长度与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著变长（P均<0.05）。

表1 造模后各组小鼠体质量变化率比较（%，±s）

表1 造模后各组小鼠体质量变化率比较（%，±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

组别对照组模型组青赤散低剂量组青赤散中剂量组青赤散高剂量组体质量变化率第1天0.95±0.02 0.97±0.01 0.95±0.03 0.94±0.02 0.92±0.04第2天1.06±0.31 1.02±0.25 1.03±0.26 1.04±0.25 1.03±0.27第3天1.03±0.29 0.96±0.18 1.01±0.16 1.02±0.27 1.03±0.29第4天1.05±0.31 0.93±0.27*1.03±0.21*#1.03±0.19*#1.02±0.22*#第5天1.07±0.34 0.89±0.16*0.95±0.17*#0.98±0.14*#1.01±0.19*#第6天1.08±0.33 0.85±0.05*0.93±0.08*#0.95±0.09*#0.99±0.14*#第7天1.09±0.13 0.78±0.04*0.86±0.06*#0.92±0.08*#0.97±0.11*#

2.3 各组小鼠结肠组织病理学变化情况和评分比较 各组小鼠结肠组织病理学变化情况见图2。由图2可见，对照组小鼠结肠组织中隐窝、腺体和黏膜结构规则、排列整齐，无炎症细胞浸润；与对照组相比，模型组小鼠结肠组织黏膜充血水肿，溃疡形成、隐窝破坏、杯状细胞减少，出现明显的急性炎症反应，炎症累及黏膜和黏膜下层；与模型组对比，青赤散低剂量组和青赤散中剂量组小鼠结肠组织中隐窝、腺体和黏膜结构明显好转，炎症细胞浸润明显减少；与青赤散中剂量相比，青赤散高剂量组小鼠结肠组织中隐窝、腺体和黏膜结构出现规则状态，并且排列整齐，炎症细胞浸润显著减少。对照组、模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织病理学评分分别为（2.03±0.49）、（13.67±3.28）、（11.42±2.81）、（7.16±1.57）、（4.69±1.03）分，其中模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织病理学评分与对照组相比显著升高（P<0.05），而青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织病理学评分与模型组相比显著降低（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠结肠组织病理学评分与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著降低（P均<0.05）。

图2 各组小鼠结肠组织病理学变化情况（HE，×200）

2.4 各组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1β mRNA相对表达量比较 各组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA相对表达量比较见表2。由表2可知，模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA相对表达量与对照组相比显著升高（P均<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA相对表达量与模型组相比显著降低（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA相对表达量与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著降低（P均<0.05）。

表2 各组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA相对表达量比较（±s）

表2 各组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA相对表达量比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

组别对照组模型组青赤散低剂量组青赤散中剂量组青赤散高剂量组TNF-αmRNA 1.36±0.27 4.98±0.83*3.06±0.59*#2.43±0.47*#1.74±0.33*#MCP-1 mRNA 1.42±0.31 3.87±0.79*2.65±0.48*#2.27±0.36*#1.54±0.27*#IL-1βmRNA 1.39±0.24 5.33±0.92*3.74±0.65*#3.13±0.48*#1.83±0.31*#

2.5 各组小鼠结肠组织中Notch、Hes1、ATOH1、MUC2蛋白相对表达量比较 各组小鼠结肠组织中Notch、Hes1、ATOH1、MUC2蛋白相对表达量比较见表3。由表3可知，模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中Notch、Hes1蛋白相对表达量与对照组相比显著升高（P均<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中Notch、Hes1蛋白相对表达量与模型组相比显著降低（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠结肠组织中Notch、Hes1蛋白相对表达量与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著降低（P均<0.05）。模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中ATOH1、MUC2蛋白相对表达量与对照组相比显著降低（P均<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中ATOH1、MUC2蛋白相对表达量与模型组相比显著升高（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠结肠组织中ATOH1、MUC2蛋白相对表达量与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著升高（P均<0.05）。

表3 各组小鼠结肠组织中Notch、Hes1、ATOH1、MUC2蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组小鼠结肠组织中Notch、Hes1、ATOH1、MUC2蛋白相对表达量比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05.

组别对照组模型组青赤散低剂量组青赤散中剂量组青赤散高剂量组Notch蛋白0.24±0.03 1.27±0.32*1.03±0.19*#0.78±0.07*#0.46±0.05*#Hes1蛋白0.31±0.04 1.18±0.29*1.07±0.21*#0.83±0.09*#0.58±0.05*#ATOH1蛋白1.16±0.23 0.37±0.06*0.45±0.06*#0.78±0.08*#1.03±0.14*#MUC2蛋白1.05±0.18 0.19±0.01*0.23±0.03*#0.31±0.07*#0.73±0.09*#

2.6 各组小鼠结肠组织中杯状细胞数比较 对照组、模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中杯状细胞数分别为（26.87±0.79）、（8.37±2.15）、（13.64±1.02）、（17.49±0.63）、（22.56±0.71）个，其中模型组、青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中杯状细胞数与对照组相比显著减少（P<0.05），青赤散低剂量组、青赤散中剂量组、青赤散高剂量组小鼠结肠组织中杯状细胞数与模型组相比显著增多（P均<0.05），青赤散高剂量组小鼠结肠组织中杯状细胞数与青赤散低剂量组、青赤散中剂量组相比显著增多（P均<0.05）。

3 讨论

UC在许多发达国家和地区较为常见，但在发展中地区该病的发病率也在逐渐上升。UC的发病可能与微生物、基因的易感性、环境和免疫等因素相关［11］，其具体机制还需要进一步的研究。但随着UC发病机制研究的不断深入，发现肠黏膜屏障功能在UC中起着重要作用，并且认为保护肠黏膜屏障功能是有效治疗UC潜在方法［12］。虽然临床UC治疗药物取得了一定的效果，但治疗出现的反应性、耐受性和不良反应等仍是不容忽视的，所以需要寻找替代或辅助治疗途径。青赤散是由赤石脂、炉甘石、黄柏、青黛、苦参、三七粉、黄柏、白岌、儿茶组成，是借鉴中医外科“痈疡”理论研制的局部灌肠方，全方共奏具有化瘀止血、清热化湿、敛疮生肌的功效，因方中含有青黛和赤石脂，故被称作青赤散。赤石脂具有吸附消化道内有毒物质、改善黏膜损伤的作用，青黛和儿茶具有化腐敛疮生肌、清热解毒的功效。苦参和黄柏具有杀菌、抗炎、抗溃疡和抗病毒的作用，对相关的炎症因子TNF-α、MCP-1和IL-1β具有较好的抑制作用。青黛也具有抗炎抗菌的效果，和白岌、三七合用，能够快速止血，保护肠黏膜，还能够解除肠道的高凝状态。炉甘石能够改善创面血液微循环，缩小创面面积和促进新生毛细血管生成。

在本研究中，我们发现青赤散在组织学改变上取得了令人满意的结果。通过HE染色结果显示，与模型组对比，低剂量青赤散和中剂量青赤散小鼠结肠组织中隐窝、腺体和黏膜结构明显好转，炎症细胞浸润明显减少；与中剂量青赤散相比，高剂量青赤散小鼠结肠组织中隐窝、腺体和黏膜结构出现规则状态，并且排列整齐，炎症细胞浸润显著减少；且与模型组相比，低剂量青赤散、中剂量青赤散和高剂量青赤散的病理学评分显著降低，高剂量青赤散的病理学评分降低最为明显。相关研究［13］表明，青赤散灌肠可能通过降低UC大鼠血清LPS、TNF-α含量，减少结肠上皮细胞凋亡，而起到治疗UC的作用。本研究中，RT-PCR实验检测结果显示，低剂量青赤散组、中剂量青赤散组和高剂量青赤散组小鼠结肠组织中TNF-α、MCP-1和IL-1βmRNA的相对表达量明显低于模型组，高剂量青赤散中TNF-α、MCP-1和1L-1βmRNA的表达与模型组相比最低，从而说明青赤散不仅改变了小鼠的组织形态学，同时降低了相关的炎症因子，而且高剂量的青赤散在组织学改变和降低炎症因子方面效果最为明显。

完整的肠黏膜屏障由上皮屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障组成，是机体防御的关键。在炎症性肠病中，UC黏膜屏障的破坏可能会加剧肠道共生微生物和毒素的入侵。肠损伤上皮屏障破坏被认为是UC病理生理学的标志。黏液层是肠道的另一个重要的黏膜屏障组成部分，黏液是由杯状细胞产生的，通常含有黏液蛋白，而肠内主要黏液成分为MUC2黏液蛋白。研究［14］显示，肠道MUC2蛋白缺乏会导致结肠炎的发生。因此，恢复黏液层的厚度以及杯状细胞的数量可能是治疗UC的有效方法。相关研究［15］表明，Notch信号通路介导细胞命运的决定和模式，Notch和Hes1特异性表达于肠隐窝。相关研究［16］表明，Notch下游效应物Hes1和ATOH1在调节肠上皮细胞发育和体内平衡中是必需的。我们的研究结果表明，给予高剂量青赤散的小鼠结肠组织中Notch和Hes1蛋白相对表达量明显降低，ATOH1和MUC2蛋白明显升高，使用高剂量青赤散的杯状细胞最多，FITC-D含量也最低。

综上所述，青赤散能够降低FITC-D含量，改善小鼠结肠组织病理学变化和Notch信号通路相关蛋白的表达，降低TNF-α、MCP-1、IL-1β的相关炎症水平，增加小鼠结肠组织中杯状细胞数量，其中高剂量的青赤散效果最为明显，提示高剂量的青赤散对DSS诱导的小鼠结肠炎具有多种保护作用，主要通过Notch信号通路来减轻肠道炎症，恢复结肠屏障功能。