负载CDMP-1和DEX的盘状脂质纳米粒对膝关节炎新西兰兔血清和滑膜组织中炎性因子的影响观察

吴晓东，李朋朋，程建，霍维玲，李国栋

1徐州市中心医院骨科，江苏徐州221009；2蚌埠医学院研究生院；3徐州市中心医院药剂科

骨关节炎（OA）是以关节疼痛和功能丧失为主要特征的一种综合征，也是一种与年龄相关的关节退行性疾病，多发生在45岁以上的人群中，全球约有4亿关节炎患者［1］。目前，OA引起关节退行性变的机制尚不清楚［2］。OA对各年龄段及特殊职业人群都有一定的影响，明显的临床症状为疼痛，严重的可以导致残疾。随着OA患者的增多且年轻化，临床医生对其也越来越重视，世界卫生组织把OA列为致残的第二大疾病［3］。目前的医疗策略不能完全治愈OA，只能减缓症状或延缓疾病的进展。OA治疗方法分为手术治疗和非手术治疗［4］。减轻或者消除疼痛、控制炎症的发展是目前治疗OA的主要手段，如何减缓或延缓OA的发展甚至是根治，已经成为临床上研究的重要课题之一。随着组织工程学及材料学的不断发展，研究者以纳米微粒作为药物的载体，可抑制OA患者的炎性反应和促进软骨的修复。2018年9月—2020年7月，本研究使用-sese-基团作为活性氧簇（ROS）反应，制备了负载地塞米松（DEX）和软骨衍生形态发生蛋白1（CDMP-1）的盘状脂质纳米粒DLNPs，然后建立新西兰兔膝关节炎模型，观察膝关节腔内注射DLNPs对膝关节炎新西兰兔血清和滑膜组织中炎性因子的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 盘状脂质纳米粒DLNPs、新西兰兔、仪器及试剂 参照文献［6］，使用-sese-基团作为活性氧簇（ROS）制备负载地塞米松（DEX）和软骨衍生形态发生蛋白1（CDMP-1）的盘状脂质纳米粒DLNPs，经鉴定性能稳定。健康雄性新西兰兔购自南京大学动物研究中心，共计35只，体质量2.0～3.0 kg。FACS CantoⅡ流式细胞仪购自美国Biosciences公司，ESJ120-4A型电子天平购自沈阳龙腾电子科量仪器有限公司。地塞米松（DEX）、软骨衍生形态发生蛋白1（CDMP-1）、家兔白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及前列腺素2（PGE2）、血清ELISA试剂盒购自江苏酶标生物公司。兔IL-1β、基质金属蛋白酶-13（MMP13）一抗及二抗购自美国Proteintech公司；兔TNF-α抗体购自美国RD公司［5］。本研究经徐州市中心医院伦理委员会批准，许可证号：SYXK（苏）2021-0017。

1.2 膝关节炎新西兰兔模型的制备、分组及DLNPs的给予方法 35只健康新西兰兔在实验室适应性饲养1周，采用随机数字法分为对照组、模型组、DEX组、CDMP-1组、DLNPs组5组，每组7只。模型组、DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔采用Hulth改良法制备膝关节炎新西兰兔模型［7］：手术暴露兔右膝关节，寻找兔内侧副韧带、内侧半月板及前交叉韧带并且将其切断，依据抽屉试验和侧方应力试验方法判定兔右膝手术后的稳定性，当确定其不稳定后，对暴露的右膝进行逐层缝合。为预防感染，术后进行抗感染及对手术部位进行消毒，抗感染药物使用青霉素，肌注，40万单位/次，1次/日［8］。对照组不进行手术。所有新西兰兔均以相同条件喂养。造模成功后，分别在第1、4、7、10天于膝关节腔内注射药物［9］：DEX组注射9.8%的DEX 5 mL，CDMP-1组注射0.53%的CDMP-1 5 mL，DLNPs组注射DLNPs（DEX浓度为9.8%，CDMP-1浓度为0.53%［6］）5 mL，对照组、模型组不给药。造模成功后第13天，耳缘静脉注射10%水合氯醛（2 mL/kg）进行麻醉，然后打开腹腔，在腹腔内寻找腹主动脉，应用采血针和真空采血管在腹主动脉处取血15 mL，常温静止放置15～20 min，4℃条件下3 000 r/min离心5 min，离心后取上清液放入冰箱-80℃冷冻保存。取完血后，手术暴露兔膝关节，取膝关节滑膜组织。

1.4 各组新西兰兔血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2检测 采用ELISA法。造模成功后第13天，耳缘静脉注射10%水合氯醛（2 mL/kg）进行麻醉，然后打开腹腔，在腹腔内寻找腹主动脉，应用采血针和真空采血管在腹主动脉处取血15 mL，常温静止放置15～20 min，4℃条件下3 000 r/min离心5 min，离心后取上清液，严格按照血清ELISA试剂盒说明书要求，检测各组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2。

1.5 各组新西兰兔滑膜组织中炎性因子IL-1β、TNF-α、MMP-13检测 采用BCA法。取滑膜组织10 mg，使用玻璃研磨器碾碎，把蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂混合液0.2 mL注入玻璃研磨器内，使用玻璃棒搅匀，形成浆液，4℃冰箱内静止放置20 min后，倒入离心管，12 000 r/min离心15 min，提取上层清液进行BCA蛋白浓度测定。吸取20μL样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μL轻摇，于37℃保温45 min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562 nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光度值从标准曲线上分别查出炎性因子IL-1β、TNF-α、MMP-13的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比较 各组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比较见表1。由表1可知，模型组、DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平与对照组相比均显著升高（P均<0.05），DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平与模型组相比均显著降低（P均<0.05），DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平组间相比，P均<0.05，且CDMP-1组最高、DLNPs组最低（P均<0.05）。

表1 各组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比较（±s）

表1 各组新西兰兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与DEX组相比，△P<0.05；与CDMP-1组相比，▲P<0.05。

组别DLNPs组CDMP-1组DEX组模型组对照组IL-1β（μg/L）32.45± 8.14*#△▲56.32± 7.98*#△42.56± 5.34*#58.32±10.32*16.22± 1.02 IL-6（μg/L）156.65±13.29*#△▲219.65±10.85*#△187.47±12.33*#236.67±21.36*57.33± 3.85 TNF-α（μg/L）429.21±35.68*#△▲687.01±40.10*#△465.58±37.60*#734.21±52.14*115.36±15.12 PGE2（μg/L）435.59±31.30*#△▲631.31±30.25*#△465.39±28.11*#653.57±26.26*315.56±14.12

2.2 各组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量比较 各组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量比较见表2。由表2可知，模型组、DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量与对照组相比均显著升高（P均<0.05），DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量与模型组相比均显著降低（P均<0.05），DEX组、CDMP-1组、DLNPs组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量组间相比，P均<0.05，且CDMP-1组最高、DLNPs组最低（P均<0.05）。

表2 各组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量比较（±s）

表2 各组新西兰兔滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13相对表达量比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与DEX组相比，△P<0.05；与CDMP-1组相比，▲P<0.05。

组别DLNPs组CDMP-1组DEX组模型组对照组IL-1β 2.39±0.55*#△▲3.75±0.21*#△2.62±0.36*#4.16±0.32*1.00 TNF-α 2.35±0.44*#△▲3.14±0.31*#△2.47±0.22*#3.52±0.34*1.00 MMP-13 1.53±0.34*#△▲2.12±0.47*#△1.65±0.56*#2.32±0.53*1.00

3 讨论

终末期膝关节治疗的最后方法是膝关节置换术［10］，但软骨特别是透明软骨无血管和神经组织分布，因此软骨细胞几乎没有增殖和迁移、自我修复和再生的潜力。膝关节炎形成期，炎性因子积聚，造成软骨的破坏，而软骨无法自我修复，最终导致膝关节的不可逆损伤，以至通过膝关节置换术来治疗。而膝关节置换术具有创伤大、花费高、易感染、术后疗效不满意及患者术后生活质量降低等缺点［11-13］。因此，如何有效延缓甚至修复或逆转软骨损伤是临床研究的重点课题。

炎症因子在关节炎的发病机理中起着关键的作用，尤其是IL-1β［14］。研究［15］显示，IL-1β可以促使NO、PGE2及基质金属蛋白酶（MMPs）等炎性细胞因子的产生。TNF-α的表达在炎性因子中也起到重要的作用，TNF-α含量的增高可以使MMPs的表达也增加，而MMPs的表达升高使关节炎的症状持续加重，直至导致严重后果。因此，减少OA引起的炎症和疼痛的主要策略是通过降低前列腺素的水平。糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的，具有很好的环氧化酶抑制活性，还在促进细胞生长、增殖、发育和再生中发挥重要作用。DEX是糖皮质激素的一种，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，并且不良反应少，故广泛应用于治疗多种疾病。本课题组引入DEX，制备了负荷DEX的纳米颗粒，通过DEX的缓慢释放，以期长时间的抑制关节炎炎性因子的表达，降低软骨破坏，促进软骨细胞的增殖、再生，从而缓解关节炎患者的疼痛。

CDMP-1是骨形态发生蛋白（BMP）家族中的新亚型，作用于骨骼系统，具有多种调节功能，特别是能促进软骨形成和发育，可在异位诱导软骨形成。大量研究［16-17］发现，CDMP-1能在体外诱导骨间充质细胞、骨膜源性细胞等，形成软骨样结构。而有研究［18］发现，关节内滑膜中的CDMP-1可以被炎性因子IL-1β抑制，进一步抑制了关节软骨的自身修复。本课题组通过制备负荷DEX与CDMP-1的具有缓释作用的纳米颗粒，DEX与CDMP-1的缓慢释放，相互促进，达到抑制炎性反应，促进软骨细胞增殖、再生，从而缓解关节炎患者的疼痛，修复软骨关节面，以期能够避免膝关节置换手术。

本文针对自主研发的盘状脂质纳米粒DLNPs对炎症因子的影响效果进行研究发现，DLNPs组与DEX组和CDMP-1组相比，对于血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2表达水平以及滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13蛋白表达水平，能够使其明显的降低，但CDMP-1组的降低不明显，可能是因为CDMP-1主要起修复作用，对炎症的影响较小。

综上所述，与单独注射DEX或CDMP-1相比，膝关节腔内注射负载CDMP-1和DEX的盘状脂质纳米粒DLNPs可以显著降低膝关节炎新西兰兔血清和滑膜组织中炎性因子的水平，并且能促进损伤软骨的修复，延缓或避免了关节置换手术的发生。本研究提示具有缓释作用的载有协同作用药物的盘状脂质纳米粒在临床上具有广阔的发展空间。