猪轮状病毒的研究进展

李虹瑾，唐玉娇，刘嘉琳，刘 斌

(1. 长春科技学院职业技术学院，长春 130600；2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

轮状病毒(Rotavirus，RV)是世界范围内引起婴幼儿及幼畜腹泻的主要病原体之一，其感染动物范围广泛，包括各类哺乳动物与禽类。轮状病毒根据VP6群特异性抗原决定簇可分为10种血清群型，分别为RV A～RV J，其中RV A、RV B和RV C与仔猪腹泻密切相关[1]。RV在7日龄内新生仔猪和21～28日龄断奶仔猪中感染率最高，其中RV A是引起仔猪严重胃肠炎的主要血清型，发病率和死亡率较高，近些年RV B和RV C也常有发生，对我国养猪行业造成重大经济损失。同时轮状病毒可以在猪和人之间跨物种传播，严重危害了我国公共卫生安全[2]。

1 猪轮状病毒形态及基因组结构

RV属于双链RNA(dsRNA)病毒中的呼肠孤病毒科(Reoviridae)，因其独有的车轮状结构而得名。RV无囊膜，在电镜下类似球形，20面体对称结构，病毒粒子直径约为70 nm。病毒粒子由三层蛋白衣壳组成，分别为外衣壳、内衣壳及核衣壳。RV含有分节段的RNA基因组，由11个dsRNA片段组成，编码6个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7及6个非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6[1-2]。病毒的中央为核芯髓，是一个电子致密的六角形核心，直径约为40 nm，核衣壳由VP2及少量VP1、VP3蛋白组成。核芯髓周围有一个电子透明层，病毒内衣壳颗粒以此向外呈辐射状排列，呈辐条状，由VP6蛋白构成。外周为由一层光滑薄膜组成的外衣壳，厚度约20 nm，由VP7和VP4两种蛋白质构成，其中VP7形成病毒的光滑表面，VP4形成病毒颗粒的尖峰[3]。病毒颗粒在电镜下以三种形式存在，分别为具有传染性的含完整双层衣壳的实心光滑型颗粒(TLP)、不含外衣壳且仅含有内衣壳的实心粗糙型颗粒(DLP)及缺失内外双层衣壳的核心颗粒(SLP/CLP)[1,3-4]。

2 流行病学

RV在全球范围内广泛分布，常存在于不同地区的人类与动物种群中。相关流行病学研究表明，在猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)中，G3、G4、G5和G9是最常见的G基因型，通常与P[6]或P[7]基因型有关[5-6]。然而，猪群中也发现其它G和P基因型的存在，如G1、G2、G6、G8，G10和P[13]、P[19]、P[23]、P[27][7-13]。近几十年来，世界各地对轮状病毒进行了广泛的流行病学研究，发现了越来越多不常见的新基因型或轮状病毒重组毒株，这些发现表明轮状病毒在自然界中可能发生跨物种传播[14-16]。2006年7月至2008年8月，泰国北部的131份粪便样本拭子中PoRV A阳性率为10.7%，其中92.9%属于罕见的P[23]基因型与G9或G3基因型组合[17]。Collins等[18]于2008年在爱尔兰的仔猪中检测到PoRV C，阳性率为4.4%，对VP7基因进行序列分析，大多数毒株具有G1基因型，两个毒株为G6基因型。Miyazaki[19]于2009年2月至2010年3月在日本粪便样本中对PoRV A进行了VP4及VP7序列分析，包括G3、G5、G9、P[7]、P[13]/[22]和P[23]基因型[19]。在中国主要以PoRV A最为常见，乔成鹏等应用巢式PCR检测方法对2015～2016 年我国东北三省地区进行猪 A、B、C群轮状病毒的流行病学调查，在321份病料样本中PoRV A阳性率为44.10%，PoRV B阳性率为2.75%，PoRV C阳性率为6.61%。Jeong等[20]于2006年在韩国6个城市收集137份粪便样本，其中PoRV C阳性率为26.3%，表明PoRV C感染在韩国的腹泻猪中广泛存在[20]。Collins等[21]于2005～2007年进行的流行病学调查中在非腹泻仔猪中检测到了PoRV A，说明PoRV A可导致猪群无症状感染，有可能是由于母源性免疫和自然减毒毒株的存在导致无症状感染的发生[21]。

3 猪轮状病毒细胞培养特性

RV虽然可以种间传播，但毒株的嗜性很大程度具有种特异性，很难在细胞培养物中增殖。Woode等在1974年首次从猪体内分离出轮状病毒，中国于1982年从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。研究发现在进行细胞培养之前先用低浓度胰蛋白酶处理，经胰酶剪切的病毒外壳蛋白VP3可促进对细胞培养物的感染，适应后病毒生长良好。关于轮状病毒增殖培养的研究主要是来源于恒河猴肾上皮的MA104细胞或肠上皮细胞系IPEC-J2和Caco-2中进行[22]。MA104细胞是最适宜轮状病毒增殖的细胞之一，10%小牛血清加高糖DMEM培养液可以满足MA104细胞的生长需要。猪轮状病毒在MA104细胞中最佳培养条件为5%CO2下37 ℃培养2～3 d。感染细胞传代18 h后出现细胞病变效应(CPE)，表现为细胞皱缩融合、细胞核固缩、空泡化，染毒细胞出现大片脱落区域, 最后细胞死亡脱落，随着传代次数增加，细胞病变程度加深[23]。

4 猪轮状病毒致病机制

RV主要靶细胞为小肠绒毛末端成熟上皮细胞。RV经口感染后，排列在小肠绒毛顶部表面的成熟吸收上皮细胞上，感染从小肠上部发展到小肠下部，某些毒株感染至结肠。感染后，RV对上皮细胞造成破坏，导致小肠绒毛长度变短，密度降低，来自肠隐窝的未成熟细胞代替成熟细胞，从而引起吸收障碍、消化不良及渗透性腹泻。RV会增加细胞内钙离子浓度，破坏细胞骨架和紧密连接，增加细胞旁通透性。此外，RV还产生非结构蛋白NSP4，这是一种肠毒素，通过磷脂酶C(PLC)依赖机制诱导内质网钙离子外流，进一步导致电解质失衡和分泌性腹泻。轮状病毒还可以通过NSP4依赖机制刺激肠道神经系统，进一步促进分泌性腹泻和增加肠道动力。在感染过程的后期，轮状病毒破坏成熟的肠细胞，进一步导致吸收不良或渗透性腹泻。在感染动物血液和全身器官中发现RV抗原、基因组RNA和感染性颗粒，全身性RV感染在疾病发病机制中的作用目前尚不清楚[1]。

病毒复制的早期阶段，VP4蛋白在病毒附着和穿入靶细胞过程中起关键作用，经胰酶裂解后产生VP5和VP8，与病毒的聚集有关，可提高病毒感染能力。有研究发现，VP4在病毒复制过程中与细胞不同的蛋白质和结构相互作用，在病毒感染早期，细胞表面发现VP4蛋白的存在，推测其与微管、细胞脂质筏、小分子GTP酶Rab5和异戊烯化Rab结合蛋白PRA1存在作用关系[24-25]。Li等[26]于2017年应用串联亲和纯化-质谱分析技术，发现VP4与细胞骨架相关蛋白的相互作用机制[26]。一些细胞表面分子如唾液酸、整联蛋白、hsc70等可以作为轮状病毒的受体或共同受体[22]。组织血型抗原介导轮状病毒附着，此外，连接黏附分子JAM-A和紧密连接蛋白ZO-1等均在轮状病毒进入MA104细胞中发挥重要作用[27-31]。感染后期，DLP组装到病毒发生基质中，内质网膜上驻留的糖蛋白VP7和胞质蛋白VP4掺入DLP中，形成成熟的、有感染性的TLP[32]。

5 猪轮状病毒临床诊断技术

PoRV主要通过粪-口途径传播，可引起猪轮状病毒病，多发于冬季和春季，症状严重程度受多方因素影响，如年龄、病毒毒株毒力强弱、是否有其它病原存在等，常表现为呕吐、厌食、腹泻。仔猪常因腹泻引起脱水而死亡，育肥猪呈隐性感染，不表现出明显症状。因临床中常与猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎病毒等冠状病毒及大肠杆菌等细菌性病原形成混合感染，使诊断难度加大，因此常通过实验室诊断技术确诊。

5.1 电子显微镜技术

应用电子显微镜技术(electron microscopy，EM)可直观地观察病毒的超微结构形态，对病毒进行快速鉴别诊断。若存在多种病毒混合感染时，只靠形态观察很难区分，而且由于设备昂贵、技术需求较高，因此临床上不能广泛应用，但在科学研究中可为病毒的分离鉴定提供重要依据。

5.2 病毒分离鉴定

研究发现，PoRV经胰蛋白酶处理后可在MA104细胞、MARC-145细胞、Vero细胞与IEC-2细胞中进行传代生长，但病毒分离时间周期较长，费用较高，不适合在临床诊断中推广[33-35]。

5.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，利用荧光物质标记抗体而对抗原进行定位，该技术特异性强、敏感性高、检测速度快，但需应用荧光显微镜判定结果，主观性较强，且实验结果不能长期保存，限制了临床中的应用。

5.4 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked Immunosorbent assays，ELISA)利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应，反应快速灵敏，可进行定性和定量，直接检测病毒的大致含量，在临床中应用较为广泛。

5.5 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)可扩增特定的DNA片段，该方法具有特异性强、灵敏性高、检测速度快的优点，可在兽医临床上进行推广。

6 猪轮状病毒防治措施

6.1 预防措施

用于PoRV防控的疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队于2015年发明了猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5 型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒 CV777 株+NX 株)，使我国猪病毒性腹泻病得到精准防控，减少了极大的经济损失。Park等[36]于2019年发表了关于针对韩国流行毒株G8P[7] 174-1、G9P[23] PRG942和G5P[7] K71的减毒三价猪轮状病毒活体疫苗的研究，可更好地控制韩国及流行毒株类似国家的猪轮状病毒病[36]。Wen等[37]将破伤风类毒素通用CD4+T细胞表位P2引入PoRV P[6]或P[7]特异性截短VP8*重组亚单位蛋白中，使免疫原性得到增强。Yu等[38]将PoRV VP6基因转入马铃薯基因组中，用含有VP6衣壳蛋白的转化马铃薯瘤组织口服免疫CD-1小鼠，成功产生抗VP6血清IgG和肠道IgA抗体效价，可诱导机体产生免疫应答反应。病毒样颗粒(VLP)没有病毒核酸，避免了病毒复制带来的一些副作用，但El-Attar等研究发现，与猪轮状病毒疫苗相比，VLP疫苗在病毒感染时具有部分保护作用，但诱导的免疫应答不足以完全抵抗轮状病毒的攻击，但前景较好，还需深入研究[39]。

6.2 治疗措施

目前针对PoRV还没有特异性治疗药物，药物研发应从抑制病毒复制、调节电解质平衡、提高动物免疫力、保护肠黏膜等方面进行。猪场还应加强饲养管理，遵循防大于治的原则，做好消毒工作，保证圈舍干燥卫生，使初生仔猪吃到初乳，增强免疫力。若发现发病猪，应隔离发病猪，及时补液，防止脱水。

7 结 语

长期以来，仔猪腹泻病一直是养猪行业的一大难题，对轮状病毒进行有效防治是减小损失、提高效益的有效手段。尽管目前已有多种安全有效的RV疫苗，但未能完全解决仔猪因RV感染所引起的严重腹泻疾病。RV发病机制及病毒与宿主间相互作用的许多关键因素尚未得到充分的了解，从而阻碍了改进疫苗和有效抗病毒疗法的发展。特别是RV进入目标宿主细胞后所进行的一系列基因调控，值得进一步研究。