纳米银诱导微生物氧化应激及其抗菌机制

潘蒋娟，李培骏*，苏东林，赵志远，李高阳，单 杨

（1 桂林理工大学化学与生物工程学院 广西桂林541004 2 湖南省农产品加工研究所 长沙410125 3 果蔬加工与质量安全国际联合实验室 长沙410125 4 湖南省农业科学院 长沙410125 5 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室 长沙410125）

银纳米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs）是以纳米技术为基础研制而成的新型纳米材料，粒径介于1～100 nm 之间，具有比表面积大、尺寸小、强表面活性、强催化性能等特点，广泛应用于医疗、食品、陶瓷、光学、纺织、化妆品、催化剂、半导体材料、低温导热材料、水质净化等方面[1-3]。银离子对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌等均有广谱、强烈的杀灭作用，这是其作为抗菌材料被研究的基础[4]。已知基于金属的纳米颗粒具有非特异性细菌毒性机制（它们不与细菌细胞中的特定受体结合），这不仅使细菌难以产生耐药性，而且扩大了抗菌活性的范围[5]。这些颗粒被提议作为传统抗生素的替代品，以克服细菌的耐药性。

AgNPs 对于细菌和霉菌等650 种微生物都具有抗菌活性[6]。目前认为AgNPs 的抗菌机制有4种：1）黏附到细胞壁和细胞膜的表面；2）渗透到细胞内部，并破坏细胞内部结构（线粒体、空泡和核糖体）和生物大分子（蛋白质、脂类和DNA）；3）诱导细胞毒性，通过产生自由基诱导氧化应激；4）调节信号传导途径。此外，还可以通过靶向免疫反应调节免疫系统[7]。可见，AgNPs 抗菌是一个综合的生物过程，涉及微生物细胞、生物大分子、基因转录和蛋白表达等，这些过程相互关联，互为因果。在这些生物过程中，活性氧（ROS）诱导的氧化应激发挥了极其重要的作用。

AgNPs 会导致不同类型细胞内活性氧聚集，发生氧化应激反应并导致细胞损伤、调亡等现象。明确AgNPs 抗菌活性机制对于客观评价其安全性，合理制备使用AgNPs 十分关键。本文结合以往关于AgNPs 胁迫微生物产生氧化应激，及其在细胞水平、转录组和蛋白质组对细胞毒性的影响研究来探究AgNPs 的氧化应激机制和抗菌作用的分子机理。

1 氧化应激的产生

氧化应激是指由于种种原因，机体有氧代谢产生的ROS 增多或机体自行清除的ROS 减少，对大多数细胞产生毒性作用，导致细胞的DNA、蛋白质和脂类破坏的病理性生物化学反应。大量研究表明，细胞内的ROS 主要由线粒体产生，是体内一类氧的单电子还原产物，当细胞内的氧被还原为自由基超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（·OH）后，就产生了ROS[8]。细胞内高水平的ROS，特别是O2-和H2O2，不仅会使酶活性降低，导致生长停止，也会导致DNA 损伤，加速基因突变[9-10]。在正常条件下，ROS 的产生和细胞中的抗氧化能力是平衡的。然而，当产生的ROS 超过细胞的抗氧化能力时，细胞正常机能遭破坏，导致氧化应激[11]。纳米粒子（NP）抗菌机制涉及NP 与细胞表面之间的直接相互作用，这会影响纳米颗粒进入并诱导氧化应激的膜的通透性，从而导致细胞生长受到抑制，并最终导致细胞死亡[12]。为了克服这种应激，细胞做出了酶或非酶的保护性反应。当氧化应激超出了细胞防御体系，细胞壁和生物大分子就会被ROS 和其自由基破坏[8]。

目前，金属纳米颗粒诱导细胞内ROS 水平升高的原因主要有3 个：1）颗粒的细胞摄取，2）金属离子的细胞外/内释放，3）在蛋白表面上的吸附，所有这些因素结合的结果诱导了细胞的氧化应激[13]。图1 表示植物和微生物细胞氧化应激的产生及其导致的细胞损伤作用[14]。

图1 纳米材料（NMs）抗菌的作用机理[14]Fig.1 Antimicrobial mechanism of nanomaterials[14]

2 氧化应激对微生物细胞的影响

生物信息学分析表明，干扰细胞膜功能和提高细胞内ROS 的产生是AgNPs 产生抗菌作用的主要途径，这表明AgNPs 可能通过影响细胞膜并释放银离子与蛋白质反应使细胞处于氧化应激状态。相对于银离子而言，细胞内ROS 的升高证实了AgNPs 引起的氧化损伤，这可能归因于纳米特性和更高的颗粒吸收效率。

首先，自由基和ROS 可以损伤细胞膜和电子传递链。AgNPs 与微生物的相互作用，开始是带较少正电荷的AgNPs 与负电荷的微生物细胞壁和细胞膜相靠近，产生静电吸引[15]。然后导致Zeta 电位下降，细胞膜形态改变，破坏细胞膜透过性和呼吸功能，最终破坏了细胞的完整性从而使细胞死亡[16]。Quinteros 等[17]利用AgNPs 使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌中ROS 增加，证明了氧化应激是通过DNA、细胞膜脂质和蛋白质水平的大分子氧化来产生的。Kora 等[18]的研究证实了ROS 对AgNPs 的抗菌作用与膜损伤具有关联，并证明了AgNPs 使细胞内产生ROS。纳米粒子可以通过扰乱氧化剂和抗氧化过程之间的平衡来加速细胞内氧化应激，造成致病菌体内ROS 的积累量超过正常水平，进而导致细胞死亡。Perez-Gutierrez 等[19]研究了对暴露于H2O2条件下的胰岛β 细胞（INS-1）的保护作用，得出纳米复合材料可以通过保护氧化酶的严重耗竭或通过直接清除ROS 来减轻H2O2诱导的细胞内氧化应激，这在维持β 细胞生理抗氧化应激中具有重要作用。

纳米材料通过产生ROS 引起氧化应激，并对细胞成分造成破坏，包括DNA 破坏，转录因子的异常激活，抗氧化剂分子的消耗，蛋白质的结合和丧失能力，并损害细胞膜[20]。氧化应激诱导ROS 可能导致线粒体损伤和脂质过氧化[21-22]。特别是，已经报道了ROS 的产生及其与细胞中的氧化应激的关系。氧化应激不仅会导致细胞中理化性质的改变，还会破坏线粒体并导致线粒体形态发生急剧变化。已知各种类型的纳米颗粒通过产生细胞内ROS 来诱导氧化应激。细胞摄取纳米颗粒和细胞内金属离子的释放是细胞内ROS 产生的重要因素。此外，ROS 的产生可能是由于纳米颗粒与细胞的相互作用导致线粒体功能障碍。体内纳米颗粒诱导细胞因子的分泌，而细胞因子的分泌又通过产生ROS 和自由基而引起次级氧化应激[13]。Yoshimoto 等[23]发现二甲苯诱导线粒体断裂和Yap1 的核积累，Yap1 是氧化应激响应转录因子，在用二甲苯处理的酵母细胞中可激活靶基因GPX2和TRX2的转录激活，表明二甲苯能够引起酵母细胞中的氧化应激。氧化应激的另一个重要影响是电子传递链，AgNPs 释放Ag+介导产生ROS，能够导致细菌参与电子传递链和质子动势的酶失活，从而使其功能丧失。AgNPs 产生的ROS使膜的渗透性增加，导致了蛋白质的泄露。而且由于氧化应激，一种重要的呼吸酶乳酸脱氢酶（LDH）活性显著降低，说明ROS 影响呼吸链的活性。Gomma[24]采用比色法研究了AgNPs 对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞呼吸链酶脱氢酶的活力，经AgNPs 作用后，其酶活力随时间下降。这些结果表明AgNPs 严重破坏了细胞膜和肽聚糖，进入细胞抑制呼吸链脱氢酶，从而导致细胞死亡。

其次，微生物生命中的氧化应激是ROS 产生与细胞中和其有害作用的能力之间的不平衡。细菌可以多种方式对氧化应激做出反应，一些分子组成存在并有助于维持细胞内还原环境或化学清除ROS。此外，特定的酶可降低ROS 的恒定水平，包括过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD）。SOD是主要的抗氧化防御酶之一，可对氧化应激做出反应，并将高毒性的超氧阴离子转化为过氧化氢。El-Houseiny 等[25]通过研究发现嗜水气单胞菌感染的群体有显著升高丙二醛（MDA）水平，说明细菌副产物可引起氧化应激，导致细胞壁和ROS 脂质过氧化增加而导致的MDA 水平升高。Hendiani等[26]通过在铜绿假单胞菌ATCC 27853 中用亚甲蓝（MB）处理下调了4 个研究的群体感应（QS）基因，即lasI，lasR，rhII和rhlR。pslA和pelF基因也观察到表达。pslA 和pelF 是psl 和Pel 多糖生物合成的生化途径中必不可少的酶。微生物为了应对AgNPs 的氧化应激，胞内的解毒酶的活性也会发生变化。Yuan 等[27]研究发现AgNPs 处理能够提高MDA 水平，而MDA 可以作为脂质过氧化物氧化应激的标记物；而且，经AgNPs 处理的菌上调谷胱甘肽S-转移酶（GSH）、下调了GSH、SOD 和过氧化氢酶（CAT）的活性。除此之外，氧化应激可以导致DNA 损伤，氧化DNA 前体能够与DNA 反应并导致DNA 损伤，通过DNA 修补机制可以恢复破坏的DNA[28]。

AgNPs 产生的氧化应激除了对细菌造成影响，还能够对真核细胞产生毒性影响。自由基和氧化应激与许多病理改变及疾病发生有关。据报道，动物和人类经常通过吸入、皮肤接触和口服途径接触AgNPs[20]。作为体外模型，细胞系经常用于测试不同纳米材料的毒性作用。例如，若干研究已经证明，AgNPs 通过氧化应激使小鼠和大鼠细胞凋亡[29]。较小粒径的AgNPs 可以轻易进入并分布在整个细胞质细胞器中[30]。然而，据报道较小的Ag-NPs（6 nm）对小鼠成纤维细胞系和人角质形成细胞系无毒[31]。张帮勇[32]以人肺癌细胞（A549）和人肝癌细胞（HepG2）为研究对象，探究AgNPs 对A549 和HepG2 细胞氧化应激作用，并探讨氧化应激与细胞毒作用关系。这是在细胞和分子水平上探究AgNPs 对A549 和HepG2 细胞毒作用机制及其差异原因，为AgNPs 的安全性评价以及应用提供毒理学资料。张斌[33]以小鼠原代肝细胞为模型，在细胞水平上对比研究了不同粒径银纳米粒子诱发细胞氧化应激的情况，对比研究了2 种粒径AgNPs 诱导细胞产生氧化应激的机制。结果证明：AgNPs 可诱发细胞出现氧化应激，且粒径小的AgNPs 比粒径大的AgNPs 毒性更大。Matsumoto等[34]发现ROS 的增加会引起组织对血管内皮细胞以及包括胰腺和角膜在内的上皮组织的损伤，发现高血糖诱导的ROS 产生促进唾液腺损伤并导致唾液分泌不足的新机制。由此可见，氧化应激对细胞造成的损伤是多方面的。

3 氧化应激对微生物基因表达和调控的影响

氧化应激是指ROS 的产生与活细胞和组织中导致炎症过程的抗氧化防御机制之间的不平衡。Wunnoo 等[35]使用桉树叶提取物一步法生物合成了bio-AgNPs，对念珠菌生物膜具有抑制作用，研究表明编码菌丝体生成和参与水解酶的基因表达下调，bio-AgNPs 用作抗氧化剂以预防与氧化应激相关的人类疾病。同时，AgNPs 可以用作念珠菌治疗的抗真菌剂，也可以掺入医疗设备中以防止生物膜形成。除了对于细胞壁和细胞膜的直接影响之外，ROS 还通过激活氧化还原敏感转录因子调节基因的表达，并通过调节信号转导引发反应[36]。Piersanti 等[37]通过分析RNA-seq 的基因表达谱，使用纤毛状四膜虫嗜热菌阐明了AgNPs 的作用机理，并将AgNPs 的转录组学与可溶性银盐AgNO3诱导作用进行了比较。研究表明，在亚致死浓度AgNPs 作用24 h 可诱导吞噬作用、转运途径、对氧化应激的响应、谷胱甘肽过氧化物酶活性、对刺激的响应、氧化还原、蛋白水解和氮代谢过程。Hong 等[38]发现高浓度的吡虫啉（IMI）主要通过下调gstmRNA 表达，抑制酶活性和肠道菌群失调而诱导氧化应激并抑制解毒系统。Jang 等[39]通过微阵列分析验证了5 nm 的AgNPs 会影响内皮和上皮细胞中基因表达的变化，并观察到在细胞培养初期白细胞介素（IL）-8 和IL-11基因的显著增长，表明氧化应激相关基因表达显著变化，同时也造成了细胞死亡、细胞凋亡和细胞生存相关基因表达的显著变化。

由上述结果显示，AgNPs 氧化应激作用并非是一个简单的生物过程，它涉及到微生物的抗药性、生物大分子损伤和代谢等多方位的生物过程。虽然目前对于氧化应激基因表达和调控已经有很多报道，但是由于细胞应激反应的复杂性，以及传统的RT-qPCR 或生物芯片技术的局限性，仍然无法从整体上把握氧化应激对于细胞生长过程和代谢的影响，因此也影响了我们对于NPs 抗菌机理的认识。

4 组学研究氧化应激对微生物的影响

目前，对于AgNPs 抗菌机理大多采用细胞层面和转录水平的研究方法，然而传统方法不能够完全理解微生物及动物细胞的应激反应。高通量测序技术能够在全基因组水平实时评估细胞在胁迫下的生长、代谢和应激等反应的转录调控（mRNA）和转录后调控（microRNA），从而提供大量的高质信息用于功能基因分析。与广泛研究的哺乳动物细胞或者其它模式生物相比，采用转录组或者转录后水平调控来研究AgNPs 致微生物氧化应激的报道还比较少。

Masri 等[12]运用RNA-seq 技术对橙皮苷共轭的银纳米颗粒处理的大肠杆菌K1 进行差异基因表达分析，并对细胞应激反应和代谢的基因进行研究。研究得出，纳米颗粒的抗菌机制可能与细胞膜破裂和氧化应激有关，并影响了大肠杆菌K1 中的新陈代谢。此外，在转录组研究中，鉴定出的转录物与氧化应激耐受基因有关，包括那些与超氧化物和过氧化物解毒有关的基因。这表明当细菌位于生物膜中时，其应对氧化应激的能力对其生存至关重要。Liu 等[40]使用生态生物膜模型，评估了几种变形链球菌分离株与链球菌和内生放线菌的共培养对蔗糖暴露后生物膜组成的影响。研究得出，分离株也可能削弱其在复杂生物膜中竞争的能力，影响健康的生物膜群落向能够引起疾病的生物膜的发展。Singh 等[41]通过对1 459 种转录物的分析发现，AgNPs 首先影响了金黄色葡萄球菌细菌毒力、抗药性和代谢（如氨基酸和碳水化合物）基因，而群体感应系统和毒力因子有可能抑制了生物膜的形成。研究表明，甚至是低浓度AgNPs都有可能导致水生系统中细菌生物膜的微扰，并对高等生命产生级联效应。Singh 等[42]对于绿脓杆菌生物膜开展了全基因转录组分析（RNA-Seq），在AgNPs 和Ag+胁迫下各有1 599 和2 458 种转录产物基因表达有差异，包括生物膜-特异性、趋化反应、群体感应和氧化应激相关基因等。AgNPs上调了氧化应激基因，下调了oxyR、ahpF和trxB基因，其中oxyR基因的降低体现了其氧化应激的提升，另外，代谢基因的分析表明氧化应激还抑制了DNA、RNA、蛋白质和糖酵解。另一项研究中，Pan 等[43]运用高质量浓度的AgNPs（15 mg/L）对扇形游仆虫（Euplotes vannus）进行胁迫，结合RNA-seq、microRNAomic 及生理生化试验探索相关的分子机制。研究得出，AgNPs 会引起扇形游仆虫对ROS 的动态防御反应，使细胞产生脱毒和修复，显著的调控了抗氧化分子和酶的基因诸如：谷胱甘肽合成酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、抗氧化蛋白、Gr、GPx、GST、BAX 抑制因子1、SOD、DnaJ 和抗坏血酸过氧化酶。

氧化应激不仅和代谢的基因有关，其累积还会增强AgNPs 的抗菌活性。Pareek 等[44]使用RNA测序的深层转录分析来解读AgNPs 如何发挥其对多重耐药性肺炎克雷伯菌抗菌作用。RNA seq数据表明，AgNPs 诱导了一种类似三氯生的杀菌机制，该机制可抑制II 型脂肪酸的生物合成。另外，释放的Ag+在肺炎克雷伯氏菌中在细胞外和细胞内均产生氧化应激。

除了转录组水平研究NPs 的抗菌机理外，近年来蛋白组学也开始逐渐被采用。因为蛋白组学能够对细胞或组织中蛋白质进行精确评估，这些差异表达或变化可以用作临床生物标记物（如细胞因子、生长因子和ROS 等），而检测这些标记物是一种检测NPs 早期对细胞损害的理想方法，并且通过高通量的方法可以发掘潜在生物毒性的新的生物标记物[45]。在蛋白组研究中，AgNPs 与含硫蛋白和酶相互作用，导致这些分子的失活。而且，细菌开始产生应激反应，表达一系列的包膜蛋白、热激蛋白和周质蛋白来保护细胞[6]。考虑到蛋白质水平调控的可能性，以及蛋白质酶促活性可能直接导致氧化应激反应中不同菌种间的变异这一事实，Fountain 等[46]利用黄曲霉分离株对氧化应激的特异性蛋白质组学分析与黄曲霉毒素生产能力的关系，并确定潜在的生物标记和宿主抗性育种的目标，鉴定出1 173 种蛋白质，差异表达了220种，表明黄曲霉毒素生产水平与氧化应激耐受性和氧化反应活力之间存在相关性。Pelaez-Soto等[47]进行了蛋白质组学分析，鉴定了33 种差异表达的蛋白质，得出可可粉提取物（CPEX）对酿酒酵母蛋白质表达谱的抗氧化应激（OS）具有保护作用。

5 结论

AgNPs 具有良好的抗菌效果，因此其产品的开发应用前景广阔，然而人们对于AgNPs 抗菌机理的研究尚不充分，因此需对AgNPs 抗菌机理深入研究。由上述研究成果可见，AgNPs 抗菌机理研究涉及到生物膜、细胞损伤和基因表达等过程，而活性氧诱导的氧化应激发挥了极其重要的作用。本文首先概述了氧化应激的产生，然后从细胞水平阐述了AgNPs 氧化应激对模式菌细胞壁、细胞膜、电子传递链和解毒酶等影响，从基因和表达水平阐述了氧化应激对关键基因表达、相关酶类和相关细胞通路的影响，最后结合转录组和蛋白组学综述了氧化应激对于细胞生长、代谢和应激等反应的转录调控和关联蛋白的影响。

虽然上述研究能够从各自的方面阐述AgNPs的抗菌机制，但是由于氧化应激效应涉及到细胞损伤、基因转录和蛋白表达的综合过程，因此如何从基因和表型上全面解析其分子机制有待深入研究。目前还没有一套完整公认的评价纳米产品生物安全性的标准方法和体系，这将给AgNPs 在生物医学领域的进一步开发应用带来潜在风险，同时大量AgNPs 产品应用可能导致的环境问题也不容忽视，AgNPs 氧化应激效应研究是纳米产业健康可持续发展的基础和保证；各国科学家都呼吁在纳米生物医疗产品被广泛应用之前，应该对其分子机制进行深入研究，因此阐明AgNPs 对微生物氧化应激作用，并进一步阐明其抗菌机制具有十分重要的意义。