传统发酵过程微生物互作研究进展

周袁璐，师 苑，陆跃乐，朱林江，陈小龙

（浙江工业大学生物工程学院 杭州310014）

发酵是人类最古老的食品保存方法之一，我国的传统发酵技术有着悠久的历史，且不同地区有着不同代表性的传统发酵食品。传统发酵过程呈开放式，环境中的微生物进入发酵食品，使其微生物种类丰富多样[1]。传统发酵一般有2 种形式：一部分发酵食品直接依赖原料及环境中的微生物进行发酵，而另一部分发酵食品通过人工接种后进行开放式发酵。然而，无论是哪种形式，发酵过程中都存在丰富的微生物体系。不同的微生物同处于一个微环境中，其群落组成随发酵条件的变化而发生变化，群落微生物生长代谢的过程推动了发酵的进行。认识发酵过程中的微生物群落结构和不同微生物之间的协同作用机制对认识传统发酵有着十分重要的意义。

在自然环境中，微生物并不是单独存在，往往是种类繁多的微生物形成一个微生态体系。不同种类的微生物之间普遍存在着多种类型的相互作用表型，包括互利共生、偏利共生、偏害共生、竞争和寄生等，如图1所示。食品传统发酵过程也是一个由多种微生物协同发酵的微生态系统，存在微生物间的相互作用，并贯穿整个发酵过程，使得发酵过程各菌群的相对丰度呈现此消彼长的状态。此外，这种微生物相互作用存在可重复的特征，即在每批次发酵的起始阶段，参与发酵的微生物的种类与数量可能有所不同，而发酵过程和成熟产品中，各批次之间微生物的种类与数量的变化却都相对一致。不同批次间的微生物群落及其演变具有可再现性，如传统发酵奶酪[2]、蚕豆酱[3]和食醋[4]等。研究并揭示发酵过程中微生物间的相互作用，对稳定发酵食品质量，提高发酵食品品质等均有一定的指导意义[5]。此外，传统发酵食品中可重复再现群落形成过程的特点，使其成为研究微生物群落生态形成机制的有效模型[6]，用于研究并揭示微环境中微生物是如何通过相互作用自然形成微生物群落体系。

图1 微生物相互作用类型Fig.1 Types of microbial interaction

近些年来，组学分析技术快速发展，高通量DNA 测序技术、RNA-seq 技术、功能基因组技术以及代谢组学技术等被广泛应用于各种传统发酵过程，能够较全面地解析微生物群落的变化情况。Wu 等[7]为认识四川小曲酒的糖化发酵剂小曲中的微生物群落，对3 个地区的成熟小曲样品进行MiSeq 高通量测序分析，结果表明，3 份小曲中细菌和真菌的多样性都有一定差异，这种差异性在细菌群落中更为明显，这可能是导致不同地区的风味差异的重要因素之一。Xie 等[8]为了解绍兴黄酒发酵过程中微生物群落结构的变化，对发酵5 d 和30 d 的黄酒发酵样品进行宏基因组测序，结果表明，发酵过程中的群落结构和功能都有所改变。在门水平上，发酵第5 天，放线菌门的菌群为优势菌落，相对丰度达87%；发酵第30 天，厚壁菌门和变形菌门的菌群成为优势菌。这些组学技术的协同应用，可从宏观和微观的角度共同分析微生物的生长代谢情况，为分析群落微生物的形成和功能提供技术支持。

1 传统发酵食品中的微生物

1.1 传统发酵食品中的微生物多样性

传统食品的发酵多为开放式的自然发酵，在发酵过程中呈现出了一个动态且独特的微生物群落结构。参与发酵的微生物主要有3 个来源：1）人工接种，包括一些乳酸菌、酵母菌、米曲霉等。这些菌株一般都经过筛选或人工改造，有着遗传性状稳定，抗逆性强，发酵产品的品质好等特点，如酱醪发酵过程中接种鲁氏酵母和球拟酵母可显著提高传统发酵酱油产品的风味和品质，且缩短发酵时间[9]；人工接种冻干的乳酸菌可有效地启发苹果酸-乳酸，改善葡萄酒风味[10]；酱曲、小曲等发酵时，人工接种高活性霉菌如米曲霉AS3.042、米根霉AS3.866 等。2）原料中存在的微生物。许多传统发酵的食品并不是通过接种特定的菌种进行发酵，而是直接依靠原料中存在的微生物进行发酵，如天然发酵的葡萄酒，是直接利用葡萄表面的微生物进行发酵的[11]，参与发酵的酵母菌除酿酒酵母外，还有汉逊酵母，假丝酵母，圆酵母等[12]。3）环境中的微生物，在发酵过程中会进入发酵食品中且参与发酵，这是地理环境不同的发酵食品呈现出不同风味的原因之一，这也导致了工业化生产发酵食品时，不同厂区的同种发酵食品有可能会呈现出不同风味[13]。

人们通过控制盐浓度、氧气含量等发酵参数来引导发酵过程，如在泡菜的发酵过程中加入了2%和食盐和1%白砂糖，并用水封住坛口，创造了一个高盐缺氧的发酵环境，以抑制杂菌生长[14]。Capece 等[11]连续4年研究了葡萄表面的酿酒酵母菌群，一共发现了6 种生物型（Biotype）的酿酒酵母。受每年葡萄收获时降雨和温度的影响，每年葡萄表面的酿酒酵母菌群都会有所不同，且酿酒酵母的丰度在葡萄表面并不占优势，然而由于酿酒酵母有着能在高糖环境下快速生长，对酒精有良好耐受性等特点[15]，使得酿酒酵母在酒精发酵的过程中占据了主导地位。到发酵结束时，发酵食品中的微生物大多以推动发酵进行的菌种为主体，这部分菌种丰度大大高于其它菌种；有一小部分相对丰度较高的菌种，多为优势菌种同门的其它菌种[2]，能在发酵环境中进行生长代谢；剩下一小部分相对丰度较低的菌种则是来自于发酵环境，原料或容器的其它菌种，发酵环境虽不适合这部分菌种生长，但对发酵环境有一定耐受程度，因此可以存在于发酵食品中。

1.2 发酵食品中的微生物群落演替

在传统发酵的过程中，随着发酵的进行，微生物产生的代谢物，如酒精、乳酸、醋酸等，改变了发酵环境，使得各个菌群的相对丰度发生变化，菌群呈现出一种此消彼长的状态，表1 列举了部分传统发酵食品中的微生物群落变化。

表1 传统发酵过程中的微生物群落变化Table 1 Changes in microbial communities during traditional fermentation processes

泡菜是中国北方的一种传统发酵食品，Liang等[19]采用了Illumina MiSeq 测序技术，变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以及定量PCR（qPCR）这3 种分析方法，研究了泡菜发酵过程中微生物相对丰度的变化。Illumina MiSeq 测序和DGGE 的结果都表明，随着发酵时间的增长，细菌菌群与真菌菌群的均匀度皆有所下降，即在发酵中后期，有优势菌群出现。由于在发酵过程中并没有接种菌种，因此发酵初期时的菌种基本都来自原料，少量来自于环境。在发酵过程中，乳酸菌（Lactobacillus）产生乳酸，使得发酵环境中的pH 值下降，可滴定酸度（Total titratable acidity，TTA）上升，抑制了其它微生物的生长，使得乳酸菌在发酵后期成为最主要的菌属。因此，在发酵过程中可以观察到，发酵初期相对丰度较高的假单胞菌（Pseudomonas）和变形杆菌（Proteobacteria），其相对丰度会随着发酵的进行而减少。

Zheng 等[20]应用变性梯度凝胶电泳的技术研究了白酒大曲的制曲过程中微生物群落的演替过程。这与泡菜发酵中的演替有所不同的是，制曲是通过控制温度与湿度，从而达到某类微生物在曲中得以富集的目的。首先在第1 阶段，将温度控制在20 ℃，使得来源于原料及环境中的中温微生物得以快速生长，接下来将温度升高至38 ℃，使曲中的酵母、霉菌以及其它耐热微生物得以富集。经过这2 个阶段，曲中的乳酸菌也得到了富集，产生的乳酸能够调节大曲的pH 值处于弱酸性，使得淀粉酶、蛋白酶等酸性酶类可以有更高的活性[21]，并使得pH 值与温度成为制曲后期微生物群落结构形成的最重要因素。

食醋是由各类谷物进行连续的酒精发酵和醋酸发酵后得到的产品，其酿造过程中也有着非常清晰的微生物群落演替过程[22]。首先，在处理过的谷物中加入大曲，曲中含有酵母（如毕赤酵母）、霉菌（如链霉菌、红曲霉）等[23]微生物，其中霉菌是大曲中的优势菌种，霉菌分泌大量的酶如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，可以水解原料中的大分子物质，为酵母菌进行酒精发酵提供了营养。在发酵的前3 d，是一个有氧发酵过程，微生物迅速利用原料中的糖分进行增殖，从第4 天开始隔绝氧气，进行厌氧发酵，在这期间酒精含量以及酵母菌的相对丰度迅速上升，酒精浓度上升会抑制杂菌的生长，经过糖化和酒精发酵阶段，乳酸菌也得到一定程度的富集，为后续的醋酸发酵做准备。酒精发酵结束后，加入老醅（上一批醋酸发酵的醋醅，含有较高丰度的醋酸菌[24]），通气进行醋酸发酵，充足的氧气使得醋酸菌和乳酸菌[4]的丰度迅速上升，发酵环境中的有机酸持续积累[18]，使环境中的pH 值下降，抑制其它微生物的生长，使得醋酸菌在该阶段成为优势菌种[25]。醋酸菌代谢放热使得环境温度升高[25]，有利于产生更多代谢产物。

发酵工艺及其关键参数控制，可为传统发酵过程中的优势微生物菌群结构变化提供主要动力。此外，微生物菌群内部也存在着许多菌种与菌种之间的相互作用。

2 传统发酵中的微生物相互作用

在一个微生物群落中，不同微生物之间的相互作用可以通过多种机制进行，如直接接触或通过信号分子等[26]。对于传统发酵过程过程，除发酵条件影响微生物群落结构变化外，其群落结构内部的相互作用贯穿了整个发酵过程，表2 列举了部分发酵食品中微生物的相互作用类型。微生物的相互作用可以赋予发酵食品特殊的风味，也对发酵食品质量的稳定性有着很大的影响。

表2 传统发酵中的微生物相互作用Table 2 Microbial interaction in traditional fermentation

2.1 传统食品发酵过程中真菌与细菌之间的相互作用

传统发酵过程中，有些发酵过程是由真菌主导的，如白酒小曲、白酒大曲、黄酒麦曲、豆腐乳、奶酪、葡萄酒等等的发酵过程，而细菌群落普遍存在于整个传统发酵过程，因此这其中就会存在大量的真菌和细菌相互作用，主要表现为偏害共生和互利共生。

葡萄酒是葡萄经由微生物的一系列发酵后产生的一种具有独特风味的酒类，具有较为明显的区域特征。虽然葡萄酒产生区域特征的决定因素还没有被确定，但目前有学者认为，不同地区的气候特点使得葡萄表面具有独特的细菌与真菌的组合[27]，这些真菌与细菌对葡萄酒的风味与质量有着十分重要的影响。葡萄表面有着复杂的微生物生态环境，包括丝状真菌、酵母菌和细菌，其中有能力在葡萄酒中生存和生长的菌株就构成了葡萄酒的微生物群落，该群落主要包括酵母、乳酸菌和醋酸菌[28]。植物乳杆菌可以通过乳酸发酵使葡萄酒脱酸，脱酸和酒精发酵过程同时进行，可以缩短葡萄酒的酿造时间，使葡萄酒的口感更好，色泽更稳定。此外，Lucio 等[29]将几株植物乳杆菌和酿酒酵母共培养后发现，酿酒酵母对植物乳杆菌的生长有较强的负面作用，这有可能是因为酿酒酵母在共培养体系中能够快速吸收必需氨基酸，维生素和生长因子，从而限制了植物乳杆菌的生长。除此之外，酿酒酵母有较高的承受恶劣环境条件的能力（高浓度的乙醇和有机酸、较低的pH 值、缺乏氧气等），使得其成为整个酿酒过程中的优势菌种。事实上，高含量酒精所产生的选择性压力已被定义为酿酒酵母在酒精发酵过程中具有优势的主要因素[30]，这也是在发酵过程中酿酒酵母与乳酸菌和非酿酒酵母呈现出偏害共生关系的主要原因。

除葡萄酒外，许多食品的发酵过程中都会出现酵母菌和乳酸菌的混合群落，如酱油、酸面团、酸奶等，且在这个过程中存在着相互作用，如图2所示。酿酒酵母和保加利亚乳杆菌在共同发酵酸奶的过程中呈现出互利共生关系，保加利亚乳杆菌会将酿酒酵母无法水解的乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，并将无法利用的半乳糖排出作为酿酒酵母的碳源，酿酒酵母则为保加利亚乳杆菌提供生长所需的丙氨酸[31]。

图2 细菌与真菌之间的相互作用Fig.2 The interaction between bacteria and fungi

在酸面团的发酵过程中，酵母菌和乳酸菌也存在互利共生关系。酿酒酵母可以产生一种生长因子刺激旧金山乳杆菌生长，且酿酒酵母还会消耗O2并产生CO2，可以改善旧金山乳杆菌的发酵性能[32]。

2.2 传统食品发酵过程中的细菌与细菌之间的相互作用

在酸奶、泡菜发酵、食醋发酵等以细菌为主导的发酵过程，细菌与细菌的相互作用尤为明显，主要类型表现为互利共生、竞争和偏害共生。

乳酸菌是一类通常产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的菌种[33]，是酸奶发酵的主要菌种。嗜热链球菌、双歧杆菌等产乳酸的菌株虽然也能独立执行酸奶发酵过程，但多个菌种发酵酸奶存在着明显的优势。Sieuwerts 等[34]研究表明嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）共同发酵酸奶时存在互利共生关系，如图3所示，嗜热链球菌可以为保加利亚乳杆菌提供嘌呤核苷酸生物合成的关键成分，包括前体甲酸和辅因子叶酸，提高保加利亚乳杆菌的生长速率。除少数能分泌胞外蛋白酶的嗜热链球菌菌株外，大部分嗜热链球菌菌株没有蛋白水解活性[26]，保加利亚乳杆菌则有着良好的蛋白水解活性，可以提供丰富的氨基酸，加快嗜热链球菌生长。除了互利共生外，有学者发现在不同的发酵环境中，这两种菌之间存在竞争作用。Liu 等[35]发现保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在脱脂牛奶中进行酸奶发酵时，发酵初期，由于保加利亚乳杆菌中不存在支链氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAA）合成途径，而且根据RNA 芯片分析表明嗜热链球菌的存在会降低保加利亚乳杆菌中用于吸收氨基酸的通透酶的表达量，这使得嗜热链球菌对环境中的BCAA 有着更大的利用优势，其在发酵初期表现出更高的生长速率。随着发酵的进行，环境中pH 值下降，保加利亚乳杆菌对低pH 值有更好的耐受性，因此在发酵中期，保加利亚乳杆菌有着更高的生长速率。

图3 细菌与细菌之间的相互作用Fig.3 The interaction between bacteria and bacteria

嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）是乳制品中常用的益生菌之一，其单独发酵时生长速率缓慢，因此在工业上不能单独作为酸奶发酵剂使用。嗜酸乳杆菌在冷藏酸奶中的存活能力也比较差，为了改善其存活能力，Li 等[36]研究了嗜酸乳杆菌分别与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵时的发酵能力和生存能力，结果表明，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的存在都会增强嗜酸乳杆菌的发酵能力。然而，保加利亚乳杆菌对嗜酸乳杆菌的生存能力有着负面影响，嗜热链球菌可以减弱这种影响，嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌进行混合发酵时，嗜酸乳杆菌的产酸能力以及生存能力均有增强，即存在互利共生关系。

双歧杆菌是一种被广泛使用的益生菌，由于双歧杆菌是专性厌氧菌，氧气的存在会引起双歧杆菌强烈的氧化应激反应，导致双歧杆菌在食品发酵中的应用受到限制。Wang 等[37]发现一株双歧杆菌（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）和一株纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisnatto）在氧气限制的条件下进行大豆固态发酵时，双歧杆菌的存活率较单独发酵时提高了3 倍，利用RNASeq 对比了混合发酵和单独发酵时的转录组后发现，当纳豆枯草芽孢杆菌存在时，双歧杆菌有关分子转运功能、碳水化合物和活性氨基酸代谢、DNA修复，氧化应激相关功能以及细胞生长的基因的表达会被大幅度上调，这些基因的表达被上调后，可以大大双歧杆菌在有氧条件下的生存能力。

2.3 真菌与真菌之间的相互作用

在葡萄酒发酵过程中，往往存在着多种酵母菌。酿酒酵母是进行酒精发酵的最主要菌株，己经被广泛研究。由于非酿酒酵母菌在酒精发酵过程中产生的次级代谢物可以提升葡萄酒的风味和品质[38]，近年来，非酿酒酵母在酒精发酵中的作用被越来越重视。Ciani 等[39]认为，酵母菌之间相互作用的影响因素可分为非生物影响因素和生物影响因素。非生物影响因素主要包括温度、氮浓度、营养物质浓度等，其中，温度和氨基氮浓度等参数显著调节酵母菌群的生长。不同的酿酒酵母菌株有不同的适宜发酵温度，有些菌株会在低温时占据发酵的主导地位，但通常的适宜温度处于20～35 ℃范围，发酵温度过高则会使剩余的糖分过多，从而导致其它微生物过多地生长。Cheraiti 等[40]研究了酒精发酵过程中，不同酵母间通过代谢物质进行的相互作用。研究表明，在葡萄酒的发酵过程中，葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）会产生大量的乙醛，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）则可以利用这些乙醛，从而使乙醛维持在一个较低的浓度，较低的乙醛浓度可以刺激酿酒酵母生长。生物影响因素主要为抗菌物质以及细胞间接触。乙醇是一种微生物生长抑制剂，在发酵初期，酿酒酵母能迅速地利用糖分产生乙醇以抑制其它微生物生长，并且酵母菌能够分泌抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）抑制其它微生物的生长[41]。除此之外，不同酵母间还存在着细胞直接接触介导的死亡机制。如Renault 等[42]观察到了当酿酒酵母与德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）直接接触时，会导致德尔布有孢圆酵母的迅速死亡。

在许多酵母菌株中都存在着葡萄糖效应，早前有学者发现有部分酵母中存在的酵母朊病毒（GAR+）可以减轻葡萄糖效应[43]，促进酵母细胞的活力且不降低其酒精发酵能力。Watanabe 等[44]发现，乳酸菌的存在可以促使酵母菌中GAR+的出现，提高酵母菌的生存能力，同时GAR+也可以减轻葡萄糖快速减少以及低浓度酒精对乳酸菌带来的不利影响。

3 微生物相互作用在发酵中的应用

微生物发酵作用不但能延长传统发酵食物的保存周期，而且能提高营养价值并产生了独特风味[45]。随着对传统发酵过程认识的不断加深，人们可以有效地利用微生物间的相互作用，对传统发酵进行改良，提高传统发酵食品的品质。

3.1 提高产品品质

酱油是一种具有咸鲜味和酱香味的发酵豆制品，在我国乃至东亚地区，都深受广大消费者的喜爱。普通传统酿造的酱油中的含盐量约为18%，盐度偏高。通过物理法对酱油成品进行除盐，会影响酱油本身的风味。Singracha 等[46]通过接种耐盐乳酸菌与耐盐酵母菌发酵减盐酱油。发酵初期乳酸菌产生乳酸降低了环境pH 值，抑制杂菌生长且有利于酵母菌产生更多挥发性风味物质。酵母菌的存在会明显增加酱油中醇类物质以及呋喃酮的含量，呋喃酮可以赋予酱油特殊的焦糖味[47]。然而，耐盐乳酸菌与耐盐酵母菌之间也存在着明显的拮抗作用，耐盐乳酸菌的存在会抑制耐盐酵母菌生长，这种拮抗作用可以通过调整接种顺序缓解，并有利于酵母菌产生更多风味物质[48]。

3.2 提高产品安全性能

在过去，人们往往更关注发酵产品的风味而忽视了其在发酵过程中产生的一些有害物质，随着人们对食品安全重视程度的提高，去除或降低发酵食品中的有害代谢产物也越来越重要。

用脱羧酶阳性菌发酵的酸奶中，都会产生一定量的酪胺，摄入过量的外源性酪胺会导致偏头痛、高血压等疾病。Yilmaz 等[49]研究了混合菌种发酵的酸奶中生物胺增长量的变化，结果表明，嗜热链球菌与植物乳杆菌混合发酵的酸奶中，生物胺的增长倍数低于两株菌种单独发酵的酸奶，说明这两株菌株在酪胺的形成中存在着拮抗作用。

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OA）是一种真菌毒素，有剧毒且可以致癌，存在于食品中会对健康造成不利的影响。酵母菌和乳酸菌都有降解该化合物的能力，若将两种菌共同接入发酵食品中时，降解效率明显高于单株菌的降解效率[50]。

在传统发酵的酸面团中，存在着麸皮蛋白，可能会引起过敏反应。Sakandara 等[51]从酸面团中分离并挑选出了良好水解麸皮蛋白活性的菌株，可用于酸面团的发酵过程中，以达到降解过敏原的目的。

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一种潜在的致癌物质，存在于许多酒精饮料，包括一些果酒和米酒产品。Fang 等[52]选用了几株能产氨基甲酸乙酯水解酶的乳酸菌，与酿酒酵母进行混合发酵，结果表明，细菌的存在可以抑制酵母菌产生EC，氨基甲酸乙酯水解酶可以水解EC，从而降低发酵产品中EC 的含量。

4 总结与展望

传统发酵食品及其控制工艺是丰富多样的，其发酵微生物的群落结构和内部的相互作用也是较为复杂，特别是我国传统固体发酵过程。总结已有的传统发酵过程的微生物相互作用发现，其作用类型主要表现为原料利用的互利生长关系、代谢物介导的偏害或偏利生长关系、营养吸收的竞争性生长关系以及适应环境的共性生长关系等。目前，这些微生物间相互作用的具体分子机理研究，主要集中在酒类、酸奶、奶酪等传统发酵过程。针对我国较为丰富多样的传统固体发酵过程，其多菌种间相互作用的具体分子机理的研究较少。这可能由于传统固态发酵过程中，代谢物介导的相互作用局限于固体发酵的某些微环境内部，且具有空间限制性和固态介质吸附性等物理特征。进一步认识多菌种联动发酵机制，可以更充分、更有效地利用发酵微生物人工接种技术，用以提高发酵食品的安全性以及风味品质，提升传统发酵的生产技术水平。

发酵食品中的微生物群落由于其具有易操纵、可再现等特点，也成为了研究微生物群落形成机理的一种模型，为研究微生物群落中物种-物种和物种-环境相互作用提供了一个新的突破点。目前对微生物间相互作用的研究的重心逐渐从菌群结构变化转向基于转录组和代谢组分析的菌种相互作用分子机理方面，可以从分子生物学层面更直接地揭示微生物间的相互作用，为传统发酵的发展提供更广阔的思路。