猪苓多糖对LPS诱导的急性肺损伤模型大鼠炎症因子的影响

李全有 刘海军

河南省安阳市中医院药剂科，河南 安阳 455000

急性肺损伤(Acute lung injuny,ALI)是一种具有高发病率和死亡率的炎性疾病[1]。ALI或更严重的形式是急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，其特征是严重的肺水肿，肺炎细胞聚集和炎性细胞因子的过量产生，导致强烈的肺部炎症反应[2]。流行病学研究报告[3]指出，ALI仍然是世界范围内重要的公共卫生问题，也是临床医生面临的重大挑战[3]。尽管已采取一些治疗策略来改善功能结局，但ALI患者的死亡率仍然很高，故需要研究ALI的潜在机制和新的治疗方法。猪苓多糖是由中药猪苓提取的多糖类物质，能够提高机体的细胞免疫功能[4]，猪苓多糖胶囊和注射剂均已获得中国食品药品监督管理局(SFDA)批准，已在中国单独或与多种临床药物联合使用来治疗乙型肝炎，肺癌和肝癌等疾病[5]。在肺部疾病中，猪苓多糖可以通过抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞的转化，抑制肺成纤维细胞的增殖和迁移而发挥有效的抗纤维化作用[6]，说明了在肺部疾病中猪苓多糖可以发挥调控作用，但是在ALI中尚未有相关研究，本项目的开展可能为ALI的治疗提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠(182～218 g)，18只，购自上海Slaccas实验动物有限公司，并以12 h光照/黑暗周期饲养在SPF实验动物室中，实验过程中对动物的处置均符合动物伦理学标准。

1.2 药物和试剂 猪苓多糖(国药准字Z10970134，广东华南药业集团有限公司)，按剂量溶于生理盐水；脂多糖(LPS)(北京索莱宝科技有限公司)，酶联免疫吸附法ELISA试剂盒(abcam)。

1.3 动物分组和模型制备 将18只大鼠随机分为三组，每组各6只：Control组，生理盐水灌胃，腹腔注射生理盐水；Model组，生理盐水灌胃，腹腔注射LPS(5 mg/kg)；猪苓多糖组，猪苓多糖(250 mg/kg)灌胃，腹腔注射LPS(5 mg/kg)。每天灌胃一次，连续5 d，之后用腹腔注射LPS(5 mg/kg)建模。建模成功后6 h，麻醉断头处死，取出左肺组织称湿重(W) ，于110 ℃烘烤24 h，称重即为干重(D) ，计算肺组织湿干重比：W/D=W(mg) /D(mg) 。收集血清以及右肺组织进行后续试验。

1.4 HE染色 提取肺组织，在缓冲液中保持48 h，之后进行脱水、浸蜡等操作，进行HE染色，苏木素染细胞核，伊红染细胞质，脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。

1.5 血清炎症因子水平检测 收集血液，4 ℃离心分离血清，分离后的血清放置在-80 ℃保存。使用ELISA试剂盒检测血清中转化生长因子(TGF)-α、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-1β的水平。

1.6 氧化自由基相关指标检测 根据ELISA试剂盒说明，检测肺组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、髓过氧化物酶(MPO) 和超氧化物歧化酶(SOD)的表达水平。

1.7 统计学分析 采用SPSS21.0版本用于统计分析。计量数据采用Mean±SD表示，服从正态分布，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察 如图1显示，Control组肺泡未见出血和水肿，细胞浸润结构清晰；Model组炎性细胞出现浸润，肺泡损伤明显，肺泡、肺间质和肺毛细血管发生水肿，肺泡壁增厚；猪苓多糖组水肿程度改善，损伤程度有一定减轻，出现少量炎性细胞浸润。

图1 HE染色

2.2 肺组织湿干重比 如表1所示，与Control组肺组织湿干重比相比，Model组肺组织湿干重比升高(P<0.05)，与Model组肺组织湿干重比相比，猪苓多糖组肺组织湿干重比降低(P<0.05)，说明猪苓多糖的治疗能够降低LPS诱导的急性肺损伤模型大鼠肺组织湿干重比。

表1 各组肺组织湿干重比

2.3 各组炎症因子水平比较 如表2所示，与Control组相比，Model组TGF-α、 IL-18、IL-6和IL-1β表达明显升高，而与Model组相比，猪苓多糖组TGF-α、 IL-18、IL-6和IL-1β表达水平有所降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组炎症因子水平比较

2.4 氧化自由基相关指标检测 如表3所示，与Control组相比，Model组MDA和MPO表达水平升高，而GSH-Px和SOD表达水平明显降低，而与Model组相比，猪苓多糖组MDA和MPO表达水平有所降低，而GSH-Px和SOD表达水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组氧化自由基相关指标检测

3 讨论

ALI是一种进展性综合征，其发病率和死亡率较高[7]。 ALI的生理特征是肺泡-毛细血管膜屏障的破坏，导致跨上皮炎性细胞的迁移和促炎性细胞因子的释放显着增加[8]。肺内皮细胞和肺泡上皮细胞均会发生损伤，导致肺功能丧失[9]。其特征在于促炎性介质的过度产生，炎性细胞的浸润以及肺泡上皮细胞的凋亡，因此抑制失控的炎症反应可能是治疗ALI的关键。猪苓的使用在中国已经有2000多年的历史，猪苓多糖是猪苓的主要成分，研究[10]表明，猪苓多糖可以通过调控有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)减轻LPS刺激的J774细胞的炎症反应，在巨噬细胞免疫调控的研究中发现，猪苓多糖可以抑制M2巨噬细胞的黏附和伪足生成，能够激活TLR2/TLR4-NF-κB信号通路，显著增强免疫调节能力[11]，说明了猪苓多糖能够参与疾病炎症反应的调控作用。

LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，已被广泛用于通过气管内插管法诱导ALI的动物模型。与Toll样受体4(TLR4)结合后，LPS诱导下游信号传导通路的激活，这些信号通路负责向肺内注入炎症性细胞(即嗜中性白细胞)并产生炎症原性细胞因子[12]。LPS与TLR4的结合还诱导IκB-α磷酸化和降解，促进核易位和NF-κB活化，并随后导致过度释放促炎性细胞因子，例如，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，白介素(IL)-1β，IL-6][13]。此外，LPS可以激活MAPK家族成员JNK，活化的JNK可以磷酸化许多线粒体蛋白，包括Bcl-2和Bcl-xl[14]。

研究通过LPS构建急性肺损伤模型大鼠进行实验操作，用猪苓多糖处理急性肺损伤模型大鼠，检测结果发现Model组肺组织损伤严重，而猪苓多糖治疗能够有一定程度缓解肺损伤；与Control组相比，Model组肺组织湿干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表达，以及MDA和MPO表达水平升高，而GSH-Px和SOD表达水平明显降低；与Model组相比，猪苓多糖组肺组织湿干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表达水平，以及MDA和MPO表达水平有所降低，而GSH-Px和SOD表达水平升高。说明了猪苓多糖可以缓解LPS诱导的急性肺损伤模型大鼠炎症反应，对于急性肺损伤的治疗研究有一定的指导意义。