尖裸鲤染色体核型分析及进化地位研究

马 凯，佟广香，张永泉，张庆渔，尹家胜，牟振波，匡友谊

(1中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150076；2西藏自治区农牧科学院 水产科学研究所， 西藏 拉萨 850002；3黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150076)

尖裸鲤(Oxygymnocyprisstewartii)属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、尖裸鲤属(Oxygymnocypris)，俗称斯氏裸鲤鱼、拉萨白鱼[1]，为我国西藏特有珍稀鱼类。尖裸鲤分布范围狭窄，仅分布于海拔3 600～4 300 m的雅鲁藏布江中游及汇入该江段的各支流[2]，种群数量极易受到自然和人为因素影响。1981年，曹文宣等[3]根据鳞片和下咽齿等表型性状，将其归为裂腹鱼类三个特化程度等级中的高度特化等级，但缺少相应的细胞遗传学证据。

尖裸鲤肉质鲜美，市场需求巨大，为西藏重要经济鱼类之一，曾为当地渔民主要渔获对象[4]，但由于过度捕捞和生境破坏，其自然资源量急剧下降，先后被列入中国濒危动物红皮书和中国脊椎动物红色名录[5-6]。为兼顾濒危物种保护和渔业资源开发利用，开展尖裸鲤的人工养殖技术研究，将其开发成养殖鱼类新品种是有效的解决途径，这样既可以避免大量捕捞野生个体又能满足市场需求。培育鱼类新品种首先需要制定种质标准，染色体是鱼类遗传物质的主要载体，其数目、长度、着丝粒位置、随体与次缢痕数目等统称为染色体核型[7]，核型分析不仅对研究鱼类演化规律、系统分类以及遗传育种等具有重要意义[8]，也是制定种质标准的重要资料。目前，关于尖裸鲤染色体核型的研究极少，仅见发表于1989和1990年的2篇文献[9-10]，但所报道的是同一份尖裸鲤染色体核型的研究结果，且由于早期拍照技术所限，获得的尖裸鲤染色体核型图谱非常模糊，也未提供详细的染色体长度、臂比等信息，无法应用于尖裸鲤种质标准编制、染色体形态特征测量等。为此，本研究以西藏自治区农牧科学院水产科学研究所和中国水产科学研究院黑龙江水产研究所联合驯养的尖裸鲤苗种为研究材料，对其进行染色体核型分析及进化地位研究，以期提供清晰可辨的尖裸鲤染色体核型图谱和染色体长度、臂比等详细数据信息，为尖裸鲤的进化生物学、人工养殖种质标准制定和杂交育种亲本选择提供细胞遗传学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2龄尖裸鲤雌雄各4尾，平均体长为(19.81±1.57) cm，平均体质量为(51.35±10.12) g/尾，由西藏自治区农牧科学院水产科学研究所繁殖，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼试验站养殖，运至实验室后于充气玻璃缸内暂养5 d，水温控制在(17±0.5) ℃，早晚各投喂1次。

1.2 方 法

1.2.1 染色体标本制备 使用35 mg/L 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸(MS-222)将试验鱼麻醉后，参照林义浩[11]的方法，按10 μg/g剂量胸腔注射胎牛血清溶解的植物血球凝集素(PHA)，20 h后按1 μg/g剂量胸腔注射1×PBS溶解的秋水仙素，4 h后剪鳃放血，于超净工作台中取出头肾后用7.5 g/L生理盐水冲洗，然后用镊子于7.5 g/L生理盐水中将头肾组织磨碎，游离出单个细胞，静置5 min沉淀磨碎组织，取上清液于15 mL离心管中，4 ℃下1 500g离心6 min收集细胞沉淀，加入12 mL 5 g/L KCl低渗液吹打均匀后，室温静置45 min，1 500g离心6 min后加入12 mL卡诺氏固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)悬浮细胞，室温静置30 min，1 500g离心6 min。重复固定2次。采用冷滴片法制片，室温干燥，使用1 μg/mL PI避光染色10 min，蒸馏水洗去残液后，室温避光晾干。

1.2.2 核型分析 使用OLYMPUS荧光显微镜观察染色体标本并拍照，每个个体选取10个以上分散较好的染色体中期分裂相进行计数，根据众数确定尖裸鲤染色体数目，选择5个清晰的染色体中期分裂相，根据耿龙武等[12]的方法使用E-ruler和Photoshop进行核型分析。染色体分组依据Levan等[13]的标准，根据其绝对长度、着丝粒位置等进行同源染色体配对[12]。

1.2.3 进化地位分析 统计对比19种(或亚种)裂腹鱼亚科鱼类的染色体核型，按小岛吉雄[14]的理论，分析尖裸鲤在裂腹鱼亚科中的进化地位。

2 结果与分析

2.1 尖裸鲤的染色体数目

试验共观察了104个分散较好的尖裸鲤染色体中期分裂相，统计结果如图1所示。由图1可知染色体众数为92，其出现频率为44.23%，据此得出尖裸鲤2n=92。

图1 尖裸鲤染色体数统计Fig.1 Chromosome number of O. stewartii

2.2 尖裸鲤的染色体核型

对尖裸鲤染色体核型进行比较分析，未见性别差异。选取5个清晰的染色体中期分裂相(图2)，依据标尺使用E-ruler软件进行测量后，统计每条染色体的绝对长度和臂比，并根据染色体绝对长度和形态特征等对其进行同源染色体配对，配对结果如图3所示。依据臂比结果将尖裸鲤染色体分为中部着丝粒染色体(m)、亚中部着丝粒染色体(sm)、亚端部着丝粒染色体(st)和端部着丝粒染色体(t)4组，每组所包含的染色体数目分别为26,28,20和18条，因此得出尖裸鲤核型公式为：26m+28sm+20st+18t，臂数(NF)=146。由表1统计结果可知，尖裸鲤染色体平均长度表现为m型>sm型>st型>t型，分别为(2.988 3±1.160 5),(2.553 9±0.542 4),(2.024 9±0.286 7)和(1.809 3±0.370 6) μm，m和sm型染色体中分别有2对及1对长度较大的染色体。

图2 尖裸鲤染色体中期分裂相Fig.2 Metaphase chromosome of O. stewartii

表1 尖裸鲤染色体类型、绝对长度和臂比Table 1 Type,absolute length and arm ratio of O. stewartii

表1(续) ContinuedTable 1

2.3 尖裸鲤的进化地位

统计已经发表的19种(或亚种)裂腹鱼亚科鱼类染色体核型(表2)发现，尖裸鲤亚端部和端部着丝粒染色体数目平均占比为40.22%，低于齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[15]和巨须裂腹鱼(Schizothoraxmacropogon)[16]等，高于骨唇黄河鱼(Chuanchialabiosa)[10]、佩枯湖裸鲤(Gymnocyprisdobula)[17]和黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsispylzovi)[10]等，进化地位在裂腹鱼亚科中处于中等水平。

表2 19种(亚种)裂腹鱼亚科鱼类的染色体核型Table 2 Karyotypes of 19 species (subspecies) of Schizothoracinae

表2(续) ContinuedTable 2

3 讨 论

3.1 尖裸鲤的染色体核型

染色体多样性在鱼类中比较常见，如分布于西辽河和洞庭湖的鲶(Silurusasotus)[20-21]，分布于洞庭湖和鄱阳湖的黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[22-23]及分布于洞庭湖和嘉陵江的大鳍鳠(Mystusmacropterus)[24-25]，在长期的地理隔离中，不同群体的遗传信息发生改变，进而产生染色体多样性。裂腹鱼亚科鱼类常生存于条件恶劣、多变的高原地区，拉萨裂腹鱼(Schizothoraxwaltoni)、异齿裂腹鱼(Schizothoraxoconnori)以及拉萨裸裂尻鱼指名亚种(Schizothoraxyounghusbandiiyounghusban-dii)[9,16]的不同群体也存在染色体多样性，以便更好地适应各自不同的生存环境。迄今为止，只有两位学者对尖裸鲤核型有过报道，余先觉等[9]于1989年首先报道了尖裸鲤2n=92，臂数(NF)=148，核型为26m+30sm+22st+14t；余祥勇等[10]于1990年发表了该结果的核型图谱。本研究得出的尖裸鲤染色体数目与两位学者所报道的结果契合，均为2n=92，但染色体分组结果和臂数略有差异。原因可能是由于早期拍照图片不清晰导致的测量误差，使臂比的统计结果出现偏差，从而影响了染色体的分组结果；也可能是本研究采集的尖裸鲤亲本在地域或遗传因素的影响下，染色体核型发生了改变。

3.2 尖裸鲤的进化地位

染色体与鱼类的演化程度具有一致性[23]，小岛吉雄[14]认为鱼类进化越高等，其染色体越收敛，表现为中部和亚中部着丝粒染色体数目趋于减少，而亚端部和端部着丝粒染色体数目趋于增多，比较显示尖裸鲤进化地位处于裂腹鱼亚科中等水平。李树深等[26]研究认为，不同鱼类在同一分类阶元下，具有较多中部和亚中部着丝粒染色体的种类是特化类群；具有较多亚端部和端部着丝粒染色体的种类是原始类群。在分类阶元限定为裂腹鱼亚科的情况下，尖裸鲤中部和亚中部着丝粒染色体平均占比较高，与裸鲤属4种鱼类处于同一水平，高于裂腹鱼属的8种鱼类，表明其与裸鲤属鱼类相同，均属于高度特化等级，这与曹文宣等[3]通过表观形态划分的特化等级结果相符，也从细胞遗传学角度为其论断提供了依据。根据尖裸鲤的染色体核型，推测其进化过程可能是裂腹鱼亚科中某一原始类群在演化过程中端部和亚端部着丝粒染色体通过着丝点融合方式[27]，导致中部和亚中部着丝粒染色体占比增加，进而演化形成现存的尖裸鲤，这一演化机制也在对大鳞鲃(Barbuscapito)[12]和何氏细鲃(Leptobarbushoeveni)[28]的研究中得到了证实。