创伤弧菌溶细胞素噬菌体单链抗体库的构建

潘振 陈杰敏 胡成进

创伤弧菌是分布在江河、沿海水域的革兰氏阴性杆菌。人通过生食或食用未经煮熟的海产品如牡蛎等而受感染,可引起急性胃肠道症状和原发性创伤弧菌性脓毒症[1]。还可由伤口暴露于含创伤弧菌的因素而直接受到感染,如清洗海鲜受伤及水上作业,导致严重肌炎,坏死性筋膜炎[2-3]。尤其对患有肝病及血液系统疾病等免疫力低下人群更易受到感染。很快引起感染性休克,多死于菌血症和多脏器功能衰竭[4-5]。

该病发病凶险,病死率高。在欧美、日本及我国沿江海水域感染时有发生。一份423例创伤弧菌伤口感染患者报道中[6],10%患者需要进行某种类型的截肢。在食源性患者病例中[7],创伤弧菌脓毒症病死率最高(39%),且在就诊时存在低血压患者死亡率则超过90%。因此,患病后及时有效诊断是创伤弧菌感染治疗及预后的关键。而临床常规培养鉴定方法繁琐,耗时较长,难以满足临床需求,故而建立及时有效的诊断方法迫切需要。

溶细胞素是创伤弧菌感染后分泌胞外的唯一外毒素,且序列保守,具有种属特性[8]。既往研究证明[9],溶细胞素具有溶细胞毒性和细胞毒作用,是引起细胞组织损伤的主要毒力因子,在创伤弧菌感染中发挥重要作用。

抗体基因工程技术快速发展,使单克隆抗体制备更加高效便捷,依据单克隆抗体特异性高、稳定好特点,可应用于病原体的快速诊断。用噬菌体展示技术构建鼠源性的单链抗体库,可大量获取针对溶细胞素的高特异性和均一性的单链抗体(single chain variable fragment antibody, scFv)[10]，对感染快速检测及免疫治疗具有重大意义。

资料与方法

一、一般材料

(一)材料

大肠杆菌XL1-Blue、噬菌粒载体pComb3XSS和辅助噬菌体VCSM13均为英国剑桥分子生物学实验室。BALB/c小鼠为SPF级,购买于山东大学实验动物中心。反转录试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶SfiI、Taq酶等购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司。高保真酶、焦碳酸二乙酯水(diethyl pyrocarbonate,DEPC)、辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠IgG、TMB(3,3’,5,5′-Tetramethylbenzidine)显色液购自上海生工。所用引物为上海Invitrogen公司合成。溶细胞素(cytolysin或vibrio vulnificus hemolysin,VvhA)为前期研究所得,分子量约为50 kDa[11]。

(二)方法

1.免疫小鼠

免疫前取小鼠尾端血作为阴性对照。免疫剂量按每只小鼠100 μg,初次免疫使用弗氏完全佐剂与溶细胞素蛋白等比例混合后注射。免疫2周后进行第二次免疫,采用弗氏不完全佐剂与抗原等比例混合后注射。1周后如上进行第三次免疫。免疫方法为皮下多点注射,在背部、腹部和腋窝处。第三次免疫1周后直接用抗原进行腹腔注射,为第四次免疫,此后隔3 d再免疫一次。免疫程序结束后,杀鼠取血,收集血清进行免疫效价测定。

2.ELISA方法检测抗体效价

用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释溶细胞素蛋白为5 μg/mL,每孔加入100 μL,4℃冰箱过夜,第二天弃掉包被液,PBS洗涤3次并拍干。每孔加入150 μL含5%脱脂牛奶的PBS缓冲液,室温封闭2 h,再用PBS洗涤3次并拍干。加入连续3倍稀释免疫后鼠的血清100 μL/孔(1∶100,1∶300,1∶900,1∶2 700,1∶8 100,1∶24 300,1∶72 900,1∶218 700),同时加入阴性对照血清稀释液100 μL/孔,空白对照孔中加入PBS 100 μL/孔。不同浓度样本孔设置3个复孔。37℃孵育2 h,0.05%的PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗板3次,再用PBS洗2次并拍干。用封闭液把HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体进行1:5 000稀释,加入100 μL/孔,在37℃孵育1.5 h,0.05%的PBST洗板3次,PBS洗2次,并拍干。加入50 μL/孔TMB溶液。37℃孵育15 min后加入2 M浓硫酸50 μL终止反应,测定450 nm处吸光度。当P(样本孔吸光度值)与N(阴性对照孔吸光度值)的比值≥2.1者判断为阳性,免疫的抗体效价是P/N≥2.1时,对应的最大稀释倍数为检测的抗体效价。

3.脾细胞总RNA提取及cDNA合成

免疫程序结束后将小鼠颈椎脱臼处死,取脾放入RNase-free的EP管中,研磨捣碎脾脏组织，以1 000 rpm 离心15 min后弃上清,用PBS洗涤细胞;用2 000 rpm离心10 min后弃上清;再加入PBS重复刚才步骤以获取脾细胞。

将脾细胞加入PBS至10 mL。用一次性吸管取适量脾细胞悬液滴到血球计数板上,静置2～3 min待细胞下沉后计数,计算计数板四角大方格的细胞数N,选取折光强发亮,形态完整的细胞计数,聚集一块的的细胞当成一个细胞计数。当细胞压在刻度线上,执行“计上不计下,数左不数右”原则。每个小鼠脾细胞数量按公式:细胞数=N/4×105。

使用TRIzol试剂提取脾细胞总RNA,并凝胶电泳检测RNA质量并测定浓度。用反转录试剂盒把提取的RNA逆转录得到cDNA模版。

4.多样性scFv基因合成

第一轮聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),通过不同引物组合从cDNA模板中得到小鼠抗体基因轻链可变区(Vκ、Vλ)和重链可变区(VΗ)。PCR反应结束后,进行2%琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收获得基因片段。第二轮PCR(OE-PCR)反应将抗体轻链可变区片段(Vκ、Vλ)和抗体重链可变区片段(VΗ)拼接成完整的scFv基因片段,该基因片段两端含有酶切位点SfiI。PCR反应结束后同样对DNA条带进行鉴定和纯化回收,测定浓度后将拼接好的scFv片段冻存在-20℃冰箱备用。

5.单链抗体库构建及其多样性验证

用SfiI酶切scFv基因及噬菌粒pComb3XSS。将酶切后的scFv片段和pComb3XSS载体进行T4连接。连接产物电转化到感受态菌XL1-Blue。电转化结束后加入SB培养基震荡生长1 h后,取出10 μL菌液连续稀释从10-1到10-6,取出100 μL分别涂布2×YT-AT平板,37℃过夜生长。通过计数平板上单克隆菌落数,计算抗体库库容。库容=菌落数×稀释倍数×100。

将剩余菌液在37℃摇晃温箱中继续生长2 h后,离心弃掉培养液上清,保留少许涂布平板2×YT-AGT平板,37℃生长过夜。次日用2×YT培养基刮取过夜生长的菌落分装到干净的保种管中,并加入终浓度为15%甘油混匀后置于-80℃冰箱冻存。此即为构建的单链抗体的噬菌体抗体库。

(三)统计学处理

结 果

一、ELISA方法检测抗体效价

免疫前血清吸光度变化不大,稳定在0.303左右;在稀释倍数8 100倍时样本吸光度为0.646,其比值>2.1,故免疫效价为8 100倍。在稀释倍数24 300样本吸光度和阴性对照相近,表明几乎没有结合性。见图1。

图1 小鼠免疫后血清效价分析

二、脾细胞计数和总RNA提取

用血球计数板计数脾细胞数量,得到一个中方格细胞数(N/4)大约为100个,故每个小鼠脾细胞总数为1×106/mL，获得细胞数量较好。

使用TRIzol试剂提取小鼠脾脏细胞总RNA后,用1%琼脂糖胶进行核酸电泳,凝胶成像仪中显示有三条清晰条带,分别是28 S、18 S和5 S,前两条带颜色较亮,第三条颜色较暗。通过测量得到总RNA浓度为220 μg/mL。说明RNA没有降解,提取效果较好。可用于下一步cDNA合成。见图 2。

图2 小鼠的脾细胞抽提总RNA结果

三、多样性scFv基因合成

以cDNA为模板,扩增鼠抗体轻链可变区和重链可变区基因片段得到Vκ、Vλ和VΗ,片段大小都在350 bp左右,符合要求。见图 3～5。

图3 PCR扩增轻链可变区Vλ

图4 PCR扩增轻链可变区Vκ

图5 PCR扩增重链可变区VΗ

通过OE-PCR反应拼接抗体轻链可变区和重链可变区,得到所需的scFv片段。拼接后的片段大小都在750 bp左右。见图6。

图6 OE-PCR扩增拼接scFv基因片段

四、单链抗体库其多样性验证及库容计算

从2×YT-AT平板上随机挑取18个单克隆菌落进行菌液PCR验证重组质粒,从琼脂糖凝胶上示有14个克隆含有目的条带750 bp。见图 7。

图7 电转化后重组子的PCR验证

标记好这14个单克隆菌落,并提取质粒,使用限制性内切酶切割质粒,通过跑胶验证,发现14个克隆含有4 300 bp和750 bp的两个条带。由此计算插入率为78%。见图 8。

图8 图8 重组质粒pComb3XSS-scFv的酶切验证

重组质粒pComb3XSS-scFv的电转化后,计数单克隆菌落计算库容,结果显示在10-5稀释倍数中有30个单克隆,由此可得噬菌体抗体库库容为3×108。见图 9。

图9 pComb3XSS-scFv噬菌体库容

讨 论

理论上从不经免疫的天然抗体库或半合成抗体库,可以获得针对任何种类抗原的高亲和力的抗体。而在试验中却发现经过免疫程序构建的抗体库更易于获得稳定好、特异性高的单克隆抗体[12]。目前研究抗体与待检测抗原、多肽及某些小分子物质作用机制并获得相应的优质抗体,免疫是最佳的选择。从免疫库中获得亲和抗体仍是主要研究方向。同时也是研究抗体生物学必要反应的途径[13]。

为了建立高特异性和高亲和性的溶细胞素单链抗体库,首先需要获得大容量的单链抗体基因片段:(1)本研究辅以弗氏佐剂通过对小鼠五次免疫程序,经间接ELISA方法得到较高的免疫血清滴度8 100倍,保证较好免疫效果。选择脾脏,获取产生抗体的所有淋巴细胞,数量达到1×107,获得大容量的总RNA,再通过RT-PCR技术获得随机化的cDNA。(2)参照《噬菌体表达实验室手册》[14]对鼠源单链抗体基因引物设计,以获取最大数量的抗体轻链和重链可变区基因片段。其次,构建抗体库使用高效的实验设计方案:①通过重叠延伸PCR反应拼接scFv抗体片段,使得抗体轻链可变区和重链可变区基因片段得以随机重组,增加scFv片段的重排数量。②使用重组质粒电转化方法,将重组噬菌粒载体pComb3XSS-scFv转化到宿主菌中,相比常规氯化钙转化方法,转化效率提高上千至上万倍,大大降低建库过程中scFv基因片段的丢失。③所用载体为美国Scripps研究所改进的第三代噬菌粒载体pComb3X家族载体,在pComb3载体基础上改进,增加包括稳定和引进SfiI盒的以克隆多种多肽片段,如Fab片段、scFv片段、多肽和展示的其他类型蛋白质。含有6×his标签和HA标签用于纯化和检测。引入琥珀终止密码子,使在非抑制性大肠杆菌终止PIII融合蛋白表达,用于产生可溶性蛋白等。

总之,本研究成功构建了重组率为78%、库容量为3×108的抗体文库。为下一步溶细胞素特异性单链抗体筛选奠定了基础，开发的单链抗体为疾病感染诊断开辟新的途径。